番茄花葉病毒外殼蛋白與煙草鐵氧還蛋白Ⅰ及IP-L蛋白的互作分析.pdf

1、番茄花葉病毒(Tomatomosaicvirus,ToMV)是煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)的成員之一,基因組為單鏈正義RNA,大小約為6.4kb,編碼了3個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白和17.6kDa的外殼蛋白(coatprotein,CP)。通過(guò)汁液機(jī)械摩擦傳播及種子帶毒傳播,番茄是其主要的寄主,對(duì)番茄的品質(zhì)和產(chǎn)量造成了嚴(yán)重的影響。國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)ToMV生物學(xué)和分子生物學(xué)特性方面做了大量的研究,為防治該病毒積累了豐富的資料。但該病毒與寄主相

2、互作用的機(jī)制尚不完全清楚。鐵氧還蛋白I(ferredoxinI,FdI)和IP-L是前期工作在煙草體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的可以與ToMVCP在體外互作的蛋白,為了進(jìn)一步了解ToMV與寄主的互作機(jī)制,本文對(duì)ToMVCP與煙草FdI及IP-L的互作進(jìn)行了初步分析。
　　 本實(shí)驗(yàn)室的前期工作已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ToMVCP與鐵氧還蛋白I(fcrrcdoxinI,FdI)可以相互作用。為了進(jìn)一步確定。FoMVCP與FdI互作的最小結(jié)合域.本文在前期的基礎(chǔ)上,利用

3、酵母雙雜交技術(shù)研究了ToMVCP與FdI的互作區(qū)域。首先。根據(jù)預(yù)測(cè)的FdI結(jié)構(gòu)域,對(duì)煙草FdI進(jìn)行分段缺失,分別為Fd△N47、Fd△N71和Fd△N112。并構(gòu)建至酵母表達(dá)載體pGADT7,用酵母雙雜交方法分析pGBKT7-CP與缺失片段的互作情況。結(jié)果表明,Fd△N47、Fd△N71和Fd△N112均能與pGBKTT-CP互作,其中,Fd△N112和pGBKT7-CP的互作程度較弱。同時(shí)。將實(shí)驗(yàn)室保存的重組質(zhì)粒pGBKT7-CP△N

4、31、pGBKT7-CP△N54、pGBKT7-CP△N106分別與pGADT7-FdI全長(zhǎng)進(jìn)行雙雜交,結(jié)果顯示3個(gè)缺失片段均可與FdI互作。綜合以上結(jié)果暫確定ToMVCP與FdI的最小結(jié)合域分別為ToMVCPC端含有a螺旋區(qū)的54個(gè)氨基酸及FdIC端32個(gè)氨基酸。
　　 為了確定FdI與ToMVCP的互作是否特異,本文將實(shí)驗(yàn)室保存的煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus.TMV)、黃瓜花葉病毒(Cucumbermo

5、saicvirus,CMV)、馬鈴薯X病毒(PotatovirusX,PVX)、煙草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus,TRV)的CP。分別與FdI進(jìn)行酵母雙雜交分析,結(jié)果表明,TMVCP、CMVCP、PVXCP、TRVCP均能與FdI互作,說(shuō)明FdI與ToMVCP的互作是非特異的。
　　 為了進(jìn)一步確定ToMVCP與煙草FdI和IP-L在煙草體內(nèi)的互作情況,本文構(gòu)建植物表達(dá)載體pSPYCE-35S-Fd、pSPYN

6、E-35S-CP和pSPYCE-35S-IP-L,利用雙分子熒光且補(bǔ)技術(shù)分析了其互作情況。結(jié)果表明,ToMVCP與煙草FdI和IP-L在煙草葉片活細(xì)胞內(nèi)互作。為了檢測(cè)病毒侵染寄主后,寄主蛋白在植物體內(nèi)的表達(dá)情況,本文構(gòu)建了IP-L基因的原核表達(dá)載體pEGX-IP-L,并導(dǎo)入大腸桿菌BL21中。在37℃培養(yǎng)、1.0mmol/LIPTG誘導(dǎo)條件下表達(dá)出融合蛋白GST-IP-L,SDS-PAGE電泳檢測(cè)分析表明成功表達(dá)出分子質(zhì)量約為44.6k