馬鈴薯Y病毒HC-Pro和甘蔗花葉病毒CP基因的克隆、原核表達(dá)與抗血清制備.pdf

1、血清學(xué)方法是植物病毒診斷和鑒定病毒的重要方法,在植物病毒的檢疫、預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)、植物病毒的定位、增殖、移動(dòng)和基因功能等方面研究中也發(fā)揮著重大作用.以往用提純的病毒粒體為抗原制備抗血清存在一些缺陷,如有些病毒含量非常低、不易提純,所得抗血清中常含有寄主蛋白的抗體等.通過基因工程技術(shù)使病毒的基因在原核細(xì)胞中表達(dá),以表達(dá)產(chǎn)物作為抗原制備抗血清,可以部分解決以上問題.該研究主要結(jié)果如下:1分別以馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)N

2、和O株系分離物的RNA為模板,通過RT-PCR克隆到PVY<'N>、PVY<'O> HC-Pro基因,并對(duì)其進(jìn)行了序列分析.測(cè)序結(jié)果表明兩個(gè)HC-Pro基因全長均為1368 nt,編碼456個(gè)氨基酸.兩個(gè)基因的核苷酸同源性為99.71％,氨基酸同源性為99.56％.2將PVY<'N> HC-Pro基因克隆到pET22b(+)上,構(gòu)建了原核表達(dá)載體pETHC,使HC-Pro基因在大腸桿菌中得到高效表達(dá).用原核表達(dá)的HC-Pro免疫家兔,獲

3、得了HC-Pro的抗血清.3應(yīng)用RT-PCR和特異引物從泰安采集的感染矮花葉病的玉米植株總RNA中擴(kuò)增到一個(gè)大約1kb的片段,與克隆載體pUC18連接后通過熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α.序列測(cè)定和結(jié)果的表明,泰安地區(qū)玉米花葉病由甘蔗花葉病毒(SCMV)引起,該病毒泰安分離物(SCMV-TA)CP基因含939個(gè)核苷酸,編碼313個(gè)氨基酸.泰安分離物和國內(nèi)報(bào)道的SCMV分離物(特別是山東分離物)有很高的氨基酸序列同源性,而與其它病毒的同源性較