石斛酚、丁香酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)初步研究.pdf

1、目的:
　　研究石斛酚、丁香酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)分子機(jī)制，為新藥創(chuàng)制提供藥代動(dòng)力學(xué)依據(jù)，為提高靶向細(xì)胞內(nèi)藥物濃度和藥物靶向療效奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.石斛酚、丁香酸的細(xì)胞靶向識(shí)別作用:以熒光標(biāo)記的石斛酚和丁香酸為實(shí)驗(yàn)材料，分別與人晶狀體上皮細(xì)胞(HLEC)、人正常肝細(xì)胞(L-02)、人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(EA.hy926)、人肺癌細(xì)胞(A549)及人結(jié)腸癌細(xì)胞(SW480)孵育，比較各組細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度，對(duì)熒

2、光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析，來間接反映兩種成分吸收進(jìn)入細(xì)胞的量，進(jìn)而判斷石斛酚和丁香酸是否具有細(xì)胞靶向性。
　　2.HLEC細(xì)胞內(nèi)石斛酚、丁香酸吸收轉(zhuǎn)運(yùn)量的濃度依賴性考察:運(yùn)用激光共聚焦掃描顯微鏡(LSCM)觀察HLEC細(xì)胞內(nèi)石斛酚、丁香酸在不同作用濃度下細(xì)胞內(nèi)的熒光分布及強(qiáng)度，探討兩種成分吸收轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入HLEC細(xì)胞的量與其濃度的相關(guān)性。
　　3.HLEC細(xì)胞內(nèi)石斛酚、丁香酸吸收量的時(shí)間依賴性考察:運(yùn)用LSCM觀察HLEC細(xì)胞內(nèi)石斛酚

3、、丁香酸在不同時(shí)間段內(nèi)細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度，探討兩種成分吸收轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入HLEC細(xì)胞的量與孵育時(shí)間的相關(guān)性。
　　4.不同細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑及特定溫度對(duì)石斛酚、丁香酸吸收轉(zhuǎn)移進(jìn)入HLEC細(xì)胞的影響:將HLEC細(xì)胞與含不同轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑的培養(yǎng)基孵育2h后，用LSCM觀察，比較各組細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度差異，計(jì)算來給你做成分的吸收抑制率。類似的，考察石斛酚、丁香酸吸收轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入HLEC細(xì)胞收溫度的影響情況。確定石斛酚、丁香酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)作用方式。
　　5

4、.用原子力顯微鏡檢測(cè)石斛酚、丁香酸跨膜運(yùn)輸過程中，HLEC細(xì)胞膜表面粗糙度及超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　結(jié)果:
　　1.石斛酚吸收進(jìn)入HLEC細(xì)胞內(nèi)的量明顯大于EA.hy926細(xì)胞，只有少量進(jìn)入L-02、A549和SW480細(xì)胞;丁香酸吸收進(jìn)入HLEC細(xì)胞及L-02細(xì)胞內(nèi)的量明顯大于SW480細(xì)胞及EA.hy926細(xì)胞，僅有少量藥物進(jìn)入A549細(xì)胞。
　　2.石斛酚作用于HLEC細(xì)胞后，隨著濃度的增加細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度也增強(qiáng)，

5、石斛酚濃度為1μg/ml時(shí)HLEC細(xì)胞內(nèi)的吸收量較大，與其它各組相比**P＜0.01，石斛酚主要分布在細(xì)胞質(zhì)中;當(dāng)石斛酚濃度達(dá)到10μg/ml時(shí)，細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大且分布在整個(gè)細(xì)胞范圍內(nèi)。
　　丁香酸作用于細(xì)胞后，隨著濃度的增加細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度也增強(qiáng)，當(dāng)丁香酸濃度小于10μg/ml時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度均較弱;當(dāng)丁香酸濃度大于或等于10μg/ml時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的吸收量最大，且分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，與其它各組相比＃＃P＜0.01。

6、
　　3.石斛酚、丁香酸分別作用于HLEC細(xì)胞時(shí)，0.5h后細(xì)胞內(nèi)即有少量熒光分子出現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度極弱，藥物攝入量較少;隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度迅速增加，培養(yǎng)時(shí)間為2h時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到峰值，后熒光強(qiáng)度迅速下降。
　　4.石斛酚作用于HLEC細(xì)胞時(shí)，受能量抑制劑2，4-DNPH與NaN3作用的影響，細(xì)胞里的熒光強(qiáng)度較對(duì)照組分別下降了64.30％和48.82％;內(nèi)吞抑制劑mβ-CD和CPZ作用HLEC細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的

7、熒光強(qiáng)度分別下降了87.02％和84.95％;硫酸蛋白受體競(jìng)爭(zhēng)抑制劑(Hep)處理后，細(xì)胞里的熒光強(qiáng)度下降了67.96％。4℃培養(yǎng)環(huán)境下石斛酚吸收進(jìn)入細(xì)胞的量降低了76.61％。
　　丁香酸作用于HLEC細(xì)胞時(shí)，受能量抑制劑2，4-DNPH作用的影響，細(xì)胞里熒光強(qiáng)度較對(duì)照組下降了69.75％，而NaN3作用HLEC細(xì)胞后，和對(duì)照組相比，無統(tǒng)計(jì)差異;內(nèi)吞抑制劑mβ-CD和CPZ作用HLEC細(xì)胞后，細(xì)胞里的熒光強(qiáng)度分別下降了88.81

8、％和72.03％; Hep處理后，細(xì)胞里的熒光強(qiáng)度下降了54.25％。4℃培養(yǎng)環(huán)境下丁香酸吸收進(jìn)入細(xì)胞的量降低了83.26％。
　　5.石斛酚、丁香酸吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過程中HLEC細(xì)胞膜表面出現(xiàn)凹坑結(jié)構(gòu):石斛酚作用后，細(xì)胞膜表面出現(xiàn)直徑150～300nm，深度40～60nm的小坑，表面粗糙度由17nm變?yōu)?6nm，細(xì)胞膜表面主要突出徑粒高度由320～350nm上升到420～450nm，細(xì)胞膜表面出現(xiàn)胞吞的凹坑結(jié)構(gòu)。丁香酸作用后，細(xì)胞膜表面

9、出現(xiàn)直徑125～350nm，深度約45～75nm的凹坑，平均粗糙度由16nm變?yōu)?8nm，細(xì)胞膜表面主要突出徑粒高度由105nm上升到210nm，細(xì)胞膜表面出現(xiàn)胞吞的凹坑結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)論:
　　石斛酚、丁香酸均能靶向性識(shí)別HLEC細(xì)胞，且跨膜進(jìn)入HLEC細(xì)胞主要分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，吸收轉(zhuǎn)運(yùn)存在時(shí)間及濃度依賴性。轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑及溫度對(duì)石斛酚、丁香酸的吸收有較大抑制作用。石斛酚、丁香酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程中HLEC細(xì)胞膜表面有凹坑出現(xiàn)。因此，石