擬南芥磷酸丙糖-磷酸轉運器新生肽（preTPT）跨膜定位機理的研究.pdf

1、葉綠體是高等植物和某些藻類進行光合作用的重要場所。葉綠體中95％以上的蛋白都是由核基因編碼，在胞質中合成后，再轉運至相應部位的。指導這些蛋白正確靶向定位的大多是其N端信號序列，也稱導肽或信號肽(transitpeptide，tp)。但是目前葉綠體蛋白轉運機理的研究結果非常少而且還存在一些分歧。因此，加強對葉綠體蛋白跨膜定位機理的研究具有十分重要的意義。磷酸丙糖/磷酸轉運器(TPT)由位于葉綠體內被膜的勻質二聚化蛋白組成，是一個高效率的運

2、輸?shù)鞍?，也是光合同化物源庫分配的重要調控位點。至今關于preTPT(TPT新生肽)定位的分子機制研究非常少。 本文主要利用基因缺失、替換和定點突變以及酵母雙雜交等方法研究了擬南芥preTPT中指導其正確靶向定位的關鍵性元件以及與之識別結合的膜轉運復合體組分，這對于闡明preTPT正確靶向葉綠體的定位機理，提高preTPT的運送效率等具有重要的理論意義。并且為作物的遺傳改良和提高產量提供有力的實驗證據(jù)。 利用RT-PCR的

3、方法擴增了擬南芥preTPT全長cDNA。軟件分析結果表明，該基因全長1233bp，編碼410個氨基酸；tp長度為83個氨基酸；tp的N端部分帶有正電荷，并且有一個14-3-3蛋白的結合位點；該蛋白還有8個跨膜結構域。為研究preTPT的定位機理，還擴增了擬南芥葉綠體被膜蛋白ceQORH(醌類氧化還原酶)和線粒體被膜蛋白Tom20的cDNA片段。并構建了preTPT-GFP，ceQORH-GFP的瞬時表達載體，并且在擬南芥葉片原生質體中

4、獲得清晰表達，在亞細胞水平上證明preTPT定位于葉綠體被膜。至此，我們建立了優(yōu)良的瞬時表達體系，為進一步研究preTPT的跨膜定位機理奠定了基礎。 通過基因序列的缺失、替換和定點突變等方法分析preTPT中指導其跨膜定位的關鍵性元件。3’端缺失、替換分析結果表明完整的tp只能將融合蛋白靶向定位到葉綠體內部，而不能指導其定位于被膜，要達到被膜定位還必須帶有preTPT的第一個跨膜結構域，并且不可以用其它的跨膜結構代替，表明第一跨

5、膜結構域與葉綠體內被膜有特異的識別和整合。對于不完整的tp(只含有preTPTN端60個氨基酸)，如在瞬時表達載體D5中，融合蛋白定位異常，星星點點的分布于葉綠體內和胞質內，這可能是由于tp缺失太多，破壞了融合蛋白與被膜轉運復合體組分的作用位點，削弱了跨膜運送進程。 進一步對preTPT5’端的缺失、定點突變分析結果表明，preTPTN端的第2到第4個氨基酸區(qū)段對其葉綠體被膜定位不起主要作用；包含第五個氨基酸及其后一段氨基酸序列

6、的結構域與與新生肽轉運的起始相關，因為這一結構域的缺失將導致融合蛋白停留在胞質。另外，電荷作用力和14-3-3蛋白對preTPT跨膜轉運的起始可能不起主要作用，因為將tpN端從正電狀態(tài)改變?yōu)橹行誀顟B(tài)或破壞14-3-3蛋白的結合位點均不影響其被膜定位。 酵母雙雜交分析表明，preTPTtp與擬南芥葉綠體被膜上的受體蛋白AtToc33和AtToc34均能發(fā)生相互作用。目前沒有實驗證明其它葉綠體內被膜蛋白利用TOC途徑跨膜定位，因此p

7、reTPT可能代表一類新的利用TOC途徑定位的葉綠體內被膜蛋白。 上述結果勾畫出擬南芥葉綠體內被膜蛋白preTPT的定位途徑，大致如下：首先新生肽最靠近N端的一個結構域與胞質某些輔助因子(14-3-3蛋白可能不起主要作用)以特定的方式(可能不是電荷作用)識別和結合，共同轉運到葉綠體被膜外側；然后與外被膜上的受體AtToc33和/或AtToc34識別結合，發(fā)生相互作用(可能還有其它TOC組分的參與)起始跨膜進程；最后在第一個跨膜結