ISEcp1介導志賀菌耐藥的分子基礎研究.pdf

1、志賀菌屬細菌又稱痢疾桿菌，是細菌性痢疾（簡稱菌?。┑牟≡w。菌痢是全球都存在的一個公共衛(wèi)生問題，尤其對發(fā)展中國家造成重大危害。志賀菌屬根據(jù)O抗原分為4個群:分別為痢疾志賀菌、福氏志賀菌、鮑氏志賀菌和宋內(nèi)志賀菌。隨著人們對各種抗生素持續(xù)廣泛的應用，甚至濫用，使志賀菌耐藥現(xiàn)象愈發(fā)嚴重，不但影響臨床療效，而且嚴重增加治療成本和新藥研發(fā)成本，并使新藥應用于臨床的周期縮短。因此，研究志賀菌耐藥機制，進而為志賀菌耐藥的防治提供科學依據(jù)和有效手段，已

2、成為目前的研究熱點。
　　插入序列(IS)是可以獨立存在的遺傳單元，是染色體的特殊組成部分，可以從染色體上的一個位置轉(zhuǎn)移到另一個位置，或在不同染色體間跳躍。最近有學者報道，ISEcp1可能與細菌β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥有關。
　　目的：
　　本課題通過藥物誘導、基因測序等手段，比較志賀菌敏感株誘導前后ISEcp1與blaCTX-M的位置關系及blaCTX-M的表達的變化，以闡明ISEcp1誘導轉(zhuǎn)座影響細菌耐藥的分子機制。

3、并進一步收集志賀菌株進行ISEcp1、blaCTX-M的分布、頭孢菌素耐藥情況及二者對應關系的分析，從而對所闡明的機制提供現(xiàn)場佐證。
　　方法：
　　1.志賀菌的收集、鑒定:從河南、江西收集志賀菌233株，并進行血清、生化鑒定;
　　2.藥敏試驗:用紙片擴散法測定菌株對所研究抗生素藥敏紙片的抑菌環(huán)，用瓊脂稀釋法測定菌株的最低抑菌濃度;
　　3.頭孢噻吩次抑菌濃度誘導實驗:采用改良K-B法篩選臨床分離、鑒定的志賀菌

4、敏感株，用瓊脂稀釋法測定志賀菌敏感株對頭孢噻吩的最低抑菌濃度，采用頭孢噻吩次抑菌濃度誘導實驗構建志賀菌誘導耐藥株;
　　4.全基因組測序分析比較志賀菌敏感株誘導前后差異:Solexa全基因組測序，并利用Clustal等生物學軟件進行比較、分析;
　　5.ISEcp1轉(zhuǎn)座及對blaCTX-M表達的影響:通過PCR、克隆和測序分析比較誘導前后ISEcp1與blaCTX-M的位置關系;并將克隆構建質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞DH5α，K-

5、B瓊脂法對不同轉(zhuǎn)化子進行藥敏試驗及超廣譜β-內(nèi)酰胺酶表型確證試驗，同時做RT-PCR，闡明ISEcp1誘導轉(zhuǎn)座后對blaCTX-M的表達的影響;
　　6.ISEcp與blaCTX-M的分布及菌株耐藥情況:PCR檢測所收集志賀菌的ISEcp1與blaCTX-M，K-B實驗進行頭孢菌素耐藥性檢測，將耐藥情況與所檢測目的基因進行對應分析。
　　結果：
　　1.對志賀菌敏感株mel-sf1998023/zz進行頭孢噻吩次抑菌濃

6、度誘導，最終得到誘導后頭孢噻吩MIC為512mg/L，是誘導前出發(fā)菌株的32倍。
　　2.頭孢噻吩誘導志賀菌敏感株mel-sf1998023/zz的前后，不但對頭孢噻吩的耐藥性發(fā)生了改變，同時測得誘導后菌株對頭孢唑啉、頭孢呋辛鈉、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟均由敏感轉(zhuǎn)變?yōu)槟退帯?br>　　3.頭孢噻吩誘導志賀菌敏感株使其耐藥后，基因組序列發(fā)生了改變，不但有SNV，還造成了新的插入和缺失，且誘導前后菌株插入序列的拷貝數(shù)發(fā)生了變化。<

7、br>　　4.通過比較志賀菌出發(fā)敏感株與誘導耐藥株的KEGG代謝通路發(fā)現(xiàn)誘導耐藥株比出發(fā)敏感株多一個代謝通路ko00930:Caprolactam degradation，即己內(nèi)酰胺代謝通路。
　　5.志賀菌被頭孢噻吩誘導后，ISEcp1轉(zhuǎn)座插入到blaCTX-M上游，且誘導后的志賀菌較誘導前對多種頭孢菌素耐藥水平顯著提高。
　　6.成功獲得重組質(zhì)粒pCTX、pISECTX，并將它們與pMD19-T空載體分別轉(zhuǎn)入DH5α感受

8、態(tài)細胞，獲得DH5α(pCTX)、DH5α(pISECTX)、DH5α(T)轉(zhuǎn)化子。對DH5α(pCTX)及DH5α(pISECTX)插入序列測序發(fā)現(xiàn)該blaCTX-M基因為blaCTX-M-55，其上游是ISEcp1含-35區(qū)和-10區(qū)啟動子位點。
　　7.DH5α(pISECTX)克隆株blaCTX-M基因表達的相對含量顯著高于DH5α(pCTX)的相對含量。
　　8.DH5α(pISECTX)較DH5α(pCTX)對下

9、列頭孢菌素均從不耐藥到耐藥，包括頭孢噻吩、頭孢呋辛鈉、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢曲松，對頭孢吡肟雖沒達到耐藥水平，但DH5α(pISECTX)較DH5α(pCTX)對頭孢吡肟的最低抑菌濃度提高了32倍。
　　9.對DH5α(T)、DH5α(pCTX)及DH5α(pISECTX)進行ESBLs表型確證試驗，判定只有DH5α(pISECTX)產(chǎn)ESBLs。
　　10.233株志賀菌株中，對頭孢噻吩、頭孢唑啉耐藥檢出率較高分別為35

10、.2％和28.3％，對頭孢呋辛鈉耐藥檢出率為13.7％，對抗生素頭孢噻肟的耐藥檢出率12.9％高于頭孢他啶9.0％，對頭孢吡肟的耐藥檢出率最低，為5.2％。共有92株對1種或1種以上頭孢菌素產(chǎn)生耐藥。志賀菌耐藥譜型分析顯示，志賀菌對6種頭孢菌素的耐藥譜型有24種。最常見的頭孢菌素耐藥譜型是頭孢噻吩、頭孢唑啉占35.87％。
　　11.1998～2001年及2003～2008年志賀菌頭孢呋辛鈉、頭孢噻肟的耐藥檢出率有逐年上升的趨勢。

11、同時期，志賀菌ISEcp1和blaCTX-M的攜帶率也有逐年上升的趨勢。
　　12.志賀菌中基因標記分布情況:
　　1)ISEcp1陽性組志賀菌對頭孢噻吩、頭孢唑啉、頭孢呋辛鈉及頭孢噻肟的耐藥檢出率高于ISEcp1陰性組志賀菌。
　　2)blaCTX-M陽性組志賀菌對頭孢呋辛鈉及頭孢噻肟的耐藥檢出率高于blaCTX-M陰性組志賀菌。
　　3)ISECTX片段陽性組志賀菌對頭孢噻吩、頭孢唑啉、頭孢呋辛鈉及頭孢噻肟的

12、耐藥檢出率高于ISECTX片段陰性組志賀菌。
　　結論：
　　1.在持續(xù)的小劑量頭孢噻吩藥物的作用下，志賀菌對頭孢菌素類抗生素的敏感性能大大降低，甚至產(chǎn)生嚴重耐藥。
　　2.頭孢噻吩誘導敏感志賀菌前后基因組序列發(fā)生改變，且誘導耐藥株比出發(fā)敏感株多一個己內(nèi)酰胺代謝通路，此代謝通路可能與誘導耐藥有關。
　　3.在外界頭孢菌素壓力下，ISEcp1可轉(zhuǎn)座插入到blaCTX-M上游，為blaCTX-M表達提供所需要的啟動子