APE1介導(dǎo)MAPK信號通路參與卵巢癌鉑類耐藥的機(jī)制研究.pdf

1、卵巢癌是最致命的婦科惡性腫瘤，占女性惡性腫瘤的3％，位居乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌、甲狀腺癌、黑素瘤、非何杰金淋巴瘤和腎臟腫瘤之后。卵巢癌占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的15%。卵巢癌組織類型多種多樣，以漿液性腫瘤為最常見的上皮組織類型。盡管近十年在卵巢癌診斷和治療中取得了很多進(jìn)展，但卵巢癌仍然是一種高致死性疾病。高死亡率的原因主要是缺乏早發(fā)現(xiàn)、早確診的有效手段和患者對化療產(chǎn)生了耐藥性導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)。
　　脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1（A

2、PE1）是參與堿基切除修復(fù)（BER）途徑的一個多功能酶，APE1能夠修復(fù)由外源性或內(nèi)源性刺激造成的氧化應(yīng)激的堿基損傷。APE1還可以作為多個轉(zhuǎn)錄因子的還原性促活劑，因此又被稱作氧化還原因子1（Ref-1）。APE1能夠活化激活蛋白1（AP-1）、核因子κB（NF-κB）、缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）、p53，對細(xì)胞凋亡、炎癥、血管生成和生存等各個方面都有重要作用。APE1/Ref-1通過活化參與不同生理過程的轉(zhuǎn)錄因子來維持細(xì)胞的氧化

3、還原的穩(wěn)態(tài)，而且還能夠調(diào)控活性氧和活性氮，與維持氧化還原平衡的物質(zhì)進(jìn)行交互，如硫氧還蛋白、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶等。APE1/Ref-1調(diào)控的生理功能包括BER途徑、轉(zhuǎn)錄因子、能量代謝、細(xì)胞骨架物質(zhì)和應(yīng)激相關(guān)反應(yīng)等。
　　通過自身的異常調(diào)節(jié)、翻譯后修飾或者序列多態(tài)性等機(jī)制，多功能酶APE1與多種疾病的發(fā)生相關(guān)，特別是不同類型的腫瘤，如卵巢癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、宮頸癌、乳腺癌、胰腺癌等。腫瘤的定義就是體內(nèi)異常細(xì)胞的不受控制的生

4、長，誘發(fā)腫瘤的機(jī)制一般是遺傳物質(zhì)的缺失、擴(kuò)增或突變。APE1不僅能夠作為遺傳學(xué)標(biāo)志，而且還可以成為靶向的分子。腫瘤細(xì)胞中APE1通常是過度表達(dá)的，APE1能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生存，也促進(jìn)腫瘤對化療和放療的抵抗。APE1的表達(dá)異常已經(jīng)被證實(shí)與多種腫瘤相關(guān)，而且內(nèi)切酶活性還與腫瘤分級呈正相關(guān)。通過APE1 siRNA（small interfering RNA）下調(diào)腫瘤細(xì)胞的APE1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)APE1對腫瘤發(fā)生發(fā)展有重要作用。下調(diào)APE1能

5、夠增強(qiáng)許多腫瘤對化療藥物的敏感性。
　　本課題組在前期的研究中已經(jīng)證實(shí)：①APE1的蛋白水平和亞細(xì)胞定位與卵巢癌的發(fā)生、鉑類藥物敏感性和臨床預(yù)后相關(guān)；②APE1在卵巢癌敏感株和耐藥株中存在表達(dá)差異，耐藥株中的蛋白水平明顯高于敏感株；③上調(diào)APE1能顯著降低卵巢癌細(xì)胞對鉑類的敏感性；④APE1的氧化還原功能對卵巢癌鉑類耐藥具有重要作用，并且參與了腫瘤的增殖。
　　盡管對APE1在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展所發(fā)揮的作用的研究已經(jīng)取得了一些

6、成果，但許多問題仍未得到圓滿的解答。APE1雖然參與了卵巢癌的鉑類耐藥，但其具體機(jī)制如何？對APE1參與鉑類耐藥的具體機(jī)制的研究能夠?yàn)槁殉舶┑呐R床治療提供新的思路。
　　絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路是細(xì)胞內(nèi)的重要的信息傳遞通路，參與了細(xì)胞的生長、分化、生存和免疫反應(yīng)等多個生理過程。哺乳動物的MAPK家族包括：細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶5(ERK5)、c-Jun氨基端激酶(JNK)和p38通路。研究發(fā)

7、現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中MAPK通路常常表現(xiàn)功能失調(diào)。多個研究證實(shí)MAPK通路參與了腫瘤發(fā)生、血管生成、化療耐藥等多個過程。那么MAPK通路和APE1是否都參與了卵巢癌的鉑類耐藥呢？MAPK通路和APE1的關(guān)系又是如何呢？
　　根據(jù)前期的研究工作，設(shè)計(jì)了下述研究方案：
　　(1)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測探討順鉑對卵巢癌細(xì)胞A2780和A2780/DDP細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平的影響；

8、　　(2)將A2780細(xì)胞和A2780/DDP細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染APE1 pcDNA3.1和APE1 siRNA片段，觀察APE1表達(dá)水平對細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響；
　　(3) Western blot檢測順鉑對卵巢癌細(xì)胞內(nèi)APE1表達(dá)及MAPK通路相關(guān)蛋白的影響；
　　(4) MTT法檢測MAPK各通路抑制劑對順鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響；
　　(5)通過N-乙酰半胱氨酸（NAC）和H2O2干預(yù)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，觀察ROS

9、水平對順鉑調(diào)控MAPK通路活性的影響；
　　(6)通過Western blot方法，從蛋白水平檢測改變細(xì)胞內(nèi)APE1表達(dá)對MAPK通路活性的影響；
　　(7) Hoechst33258染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測ROS水平、APE1表達(dá)對順鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響；
　　(8) Western blot檢測APE1表達(dá)和ROS水平對p38 MAPK通路活性和凋亡通路相關(guān)因子的影響；
　　(9)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

10、，觀察順鉑、APE1和p38 MAPK通路對細(xì)胞周期的影響。
　　(10)構(gòu)建裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型，觀察APE1與MAPK通路抑制劑對卵巢癌細(xì)胞順鉑敏感性的影響。
　　通過上述實(shí)驗(yàn)，得到了以下結(jié)果：
　　(1)順鉑作用于卵巢癌細(xì)胞后，能夠顯著增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平，2小時后ROS水平達(dá)到峰值，并維持峰值至24h，48h后ROS水平下降；A2780/DDP中ROS水平低于A2780水平。
　　(2)通過轉(zhuǎn)染APE

11、1 pcDNA3.1和APE1 siRNA片段，發(fā)現(xiàn)上調(diào)APE1表達(dá)能夠降低順鉑刺激細(xì)胞所引起的ROS水平的升高，而下調(diào)APE1表達(dá)使細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，APE1對細(xì)胞內(nèi)ROS水平有調(diào)控作用。
　　(3)通過NAC與H2O2干預(yù)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，證實(shí)順鉑通過ROS調(diào)控MAPK通路的活性。NAC能夠抑制順鉑所誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞的凋亡，而H2O2與順鉑協(xié)同促進(jìn)了卵巢癌細(xì)胞的凋亡。
　　(4)順鉑作用于卵巢癌細(xì)胞后，通過ROS激活

12、細(xì)胞內(nèi)MAPK通路。
　　(5)MTT法檢測結(jié)果表明p38 MAPK通路抑制劑SB203580能夠減弱細(xì)胞對順鉑的敏感性，ERK抑制劑與JNK抑制劑能夠增加細(xì)胞對順鉑的敏感性。
　　(6)通過改變卵巢癌細(xì)胞內(nèi)APE1的表達(dá)，并干預(yù)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，發(fā)現(xiàn)APE1可通過調(diào)控ROS水平進(jìn)而影響p38 MAPK的活性。
　　(7)Hoechst33258染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明NAC能夠抑制順鉑所誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞的凋亡，而

13、H2O2與順鉑協(xié)同促進(jìn)了卵巢癌細(xì)胞的凋亡，提示順鉑通過ROS影響細(xì)胞凋亡。而APE1也通過調(diào)控ROS水平影響順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　(8)順鉑能夠促進(jìn)Cyt C的釋放，激活Caspase家族，Caspase-3與Caspase-9剪切體水平上調(diào)。上調(diào)APE1表達(dá)能夠通過降低ROS水平抑制p38 MAPK的活性，從而減少了凋亡通路相關(guān)因子的表達(dá)。
　　(9)順鉑刺激能夠使卵巢癌細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，上調(diào)APE1與抑制p38 M

14、APK的活性能減少G1期比例，細(xì)胞增殖指數(shù)增加。
　　(10)成功構(gòu)建裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型，在活體中驗(yàn)證了APE1與p38 MAPK通路對卵巢癌細(xì)胞順鉑敏感性的影響。
　　綜上所述，在前期工作的基礎(chǔ)上，通過對A2780和A2780/DDP細(xì)胞內(nèi)APE1表達(dá)與MAPK通路的相關(guān)性進(jìn)行了進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)卵巢癌細(xì)胞中ROS水平的改變與MAPK通路的活性呈正相關(guān)。順鉑能夠通過ROS影響MAPK的活性。而且利用已構(gòu)建好的APE1

15、pcDNA3.1質(zhì)粒和APE1 siRNA片段改變卵巢癌細(xì)胞中APE1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)APE1的表達(dá)對卵巢癌細(xì)胞內(nèi)的ROS水平起著調(diào)控作用，而ROS水平又與MAPK通路的活性相關(guān)。進(jìn)一步說明了ROS、MAPK通路與APE1表達(dá)之間的關(guān)系。順鉑敏感細(xì)胞株A2780中的p38 MAPK活性較順鉑耐藥細(xì)胞株A2780/DDP中的活性增加，而抑制p38 MAPK通路減少了順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡效應(yīng)，說明p38 MAPK的活性在順鉑耐藥機(jī)制中發(fā)揮了重