HIF-1介導SCF的表達調(diào)控參與胰腺癌細胞適應乏氧環(huán)境的基礎研究.pdf

1、目的:
　　胰腺癌是一種主要來源于胰腺導管細胞的惡性實體腫瘤。近年來胰腺癌發(fā)病率在國內(nèi)外均呈穩(wěn)固上升趨勢，每10年增加15％左右。胰腺癌是目前預后最差的消化系統(tǒng)腫瘤，五年生存率僅4％。盡管外科手術和化療有很大的改進，但近20年來胰腺癌患者的預后并未有明顯改善。目前多項研究表明，缺氧是實體瘤中存在的一種普遍現(xiàn)象，其作為應激原，可激活腫瘤細胞內(nèi)的一系列基因?qū)Ψρ踝鞒鰬鸱磻?，從而改變腫瘤生物學行為，如細胞增殖、細胞凋亡抑制、腫瘤血管形

2、成、能量代謝及侵襲轉(zhuǎn)移等，使腫瘤適應乏氧微環(huán)境，增加了臨床治療的困難。胰腺癌是一個典型的乏氧實體腫瘤，胰腺癌患者的CT檢查常表現(xiàn)為腫瘤性占位性病變的中心有缺血壞死低密度灶，并且在增強掃描時腫瘤壞死病灶無增強，提示腫瘤內(nèi)缺乏有效血管，處于缺氧狀態(tài)。因此，乏氧狀態(tài)下，對其相關基因調(diào)控機制的研究，可能為胰腺癌有效治療提供新的思路。
　　在眾多參與細胞乏氧狀態(tài)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子中研究最深入的、作用最強的當屬乏氧誘導因子(hypoxia ind

3、ucible factor，HIF)，其能特異性地結(jié)合于一種低氧反應元件(hypoxia-responsive element，HRE)(5’-RCGTG-3’)調(diào)節(jié)其靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，改變腫瘤細胞的生物學行為。有研究表明，低氧微環(huán)境可以誘導SCF的表達，SCF是一種干細胞因子，表達于多種腫瘤細胞的表面，在腫瘤細胞增殖、血管新生等方面有重要作用。因此，我們推測胰腺癌細胞在乏氧環(huán)境下可通過HIF調(diào)節(jié)SCF的表達，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。

4、通過相關的實驗技術初步觀察胰腺癌組織中HIF-1與SCF表達相關性，驗證乏氧環(huán)境下HIF-1與SCF之間的相互調(diào)節(jié)關系及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。
　　方法:
　　一、胰腺癌組織中SCF與HIF-1的表達情況1.利用免疫組化方法檢測SCF、HIF-1在胰腺組織中的表達，初步分析SCF與HIF-1的表達相關性。
　　二、胰腺癌細胞中HIF-1α、c-kit的基礎表達情況1.本研究選擇胰腺癌細胞系MIA PaCa-2、BxPC-3、P

5、ANC-1、Capan-1為研究對象。采用流式細胞技術分析不同胰腺癌細胞中c-kit(CD117)的表達，為下一步實驗選擇合適的細胞系。
　　2.靜息狀態(tài)下，提取胰腺癌細胞蛋白，應用Western blot方法檢測不同胰腺癌細胞中HIF-1α蛋白的基礎表達情況；
　　三、明確乏氧狀態(tài)下胰腺癌細胞中HIF-1與SCF表達水平及調(diào)節(jié)關系1.實驗選擇胰腺癌細胞系BxPC-3、PANC-1為研究對象，采用1％O2、5％CO2、94％

6、N2混合氣體對密閉培養(yǎng)箱中細胞進行不同時間乏氧培養(yǎng)。
　　2.應用細胞轉(zhuǎn)染和小RNA干擾技術下調(diào)HIF-1α的表達后，分別應用Western blot和RT-PCR檢測不同處理條件下胰腺癌細胞中SCF、HIF-1α、VEGF及內(nèi)參β-actin蛋白和基因的表達情況。
　　四、研究乏氧狀態(tài)下HIF-1與SCF的相互作用形式以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制1.采用染色體免疫共沉淀技術(ChIP)明確HIF-1對SCF的調(diào)控形式。
　　2.

7、應用HIF-1過表達載體、SCF基因啟動子或突變的SCF基因啟動子熒光素酶表達載體，共同轉(zhuǎn)染胰腺癌細胞，采用雙熒光素酶分析法，定量檢測HIF-1調(diào)控SCF基因轉(zhuǎn)錄激活的能力。
　　結(jié)果:
　　HIF-1和SCF在胰腺癌組織中的表達均明顯高于正常胰腺組織，且兩者呈正相關。流式細胞技術結(jié)果顯示BxPC-3、PANC-1高表達c-kit，結(jié)合western blot結(jié)果選擇：BxPC-3、PANC-1作為體外實驗研究對象；經(jīng)過不同

8、時間的乏氧處理后，HIF-1與SCF蛋白在低氧環(huán)境下表達增加，并呈現(xiàn)同步性。通過RNA干擾技術沉默乏氧誘導因子-1(HIF-1)的表達后，westem blot及RT-PCR結(jié)果顯示，可以同時抑制SCF的mRNA與蛋白表達，而對照組沒有抑制效果；進一步的研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1可以直接結(jié)合于SCF基因啟動子區(qū)的乏氧反應原件(HRE)，并且可以上調(diào)SCF啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。
　　結(jié)論:
　　乏氧環(huán)境下HIF-1是調(diào)節(jié)SCF表達的關鍵