骨髓來源細胞腺苷A2A受體調(diào)控的炎性效應對慢性低灌注白質(zhì)損傷的影響及其機制探討.pdf

1、背景:
　　缺血性白質(zhì)腦病(whitematterlesion)是由大腦半球深穿支小動脈(Deepperforatorssmallartery)的廣泛病變,或頸部大動脈及其顱內(nèi)分支狹窄,導致持續(xù)腦血流低灌注,從而造成以半卵圓區(qū)及側腦室旁白質(zhì)疏松為其病理特點,臨床以認知損害為突出表現(xiàn)的疾病狀態(tài),是中老年血管性認知損害的主要類型之一。目前對于缺血性白質(zhì)腦病的分子病理機制認識尚不足,因而制約了治療藥物的研發(fā),臨床缺少有效藥物治療手段。因

2、此,迫切需要更深入地探討缺血性白質(zhì)腦病的分子病理機制,以期進而提出有效的治療策略和方法。
　　腺苷是能量代謝的中間產(chǎn)物,也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)調(diào)質(zhì)。腺苷A2A受體參與機體多種生理活動的調(diào)節(jié)和某些疾病的病理過程,在某些疾病的臨床研究和動物實驗中發(fā)現(xiàn),腺苷A2A受體及其介導的信號通路可能成為治療的靶點,因此愈來愈受到基礎和臨床研究者的重視。目前,以腺苷A2A受體作為治療靶點的多種藥物已經(jīng)進入臨床試驗,包括帕金森病、Huntingt

3、on病、全身炎性反應綜合征和艾滋病等的藥物臨床試驗。
　　本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)慢性低灌注白質(zhì)損傷病理機制不同于急性缺血性腦損傷,腺苷A2A受體介導的炎性效應是影響慢性低灌注白質(zhì)損傷結局的重要因素。腺苷A2A受體也存在于外周血液中骨髓來源細胞,Yu等在急性腦缺血的動物實驗中發(fā)現(xiàn)骨髓來源細胞腺苷A2A受體的選擇性缺失影響腦組織內(nèi)炎性介質(zhì)的產(chǎn)生,提示骨髓來源細胞A2A受體可能對缺血誘導的腦內(nèi)炎性反應產(chǎn)生重要的調(diào)節(jié)作用。
　　為

4、了進一步探討腺苷A2A受體介導的效應對慢性低灌注白質(zhì)損傷炎性病理過程產(chǎn)生影響的可能機制,我們進行了以下研究:①利用腺苷A2A受體基因敲除動物,采用骨髓移植細胞嵌合的方法建立骨髓來源細胞腺苷A2A受體選擇性缺失和選擇性重建的動物模型,觀察對慢性低灌注白質(zhì)損傷的影響,以明確腺苷作用于A2A受體并對慢性低灌注白質(zhì)損傷產(chǎn)生影響的具體效應細胞;②檢測慢性腦血流低灌注誘導的局限表達于免疫細胞和炎細胞的信號轉導分子CystatinF表達的改變,并觀察

5、干預腺苷A2A受體活性對其表達及慢性低灌注白質(zhì)損傷結局的影響,探討腺苷A2A受體對慢性低灌注白質(zhì)損傷產(chǎn)生影響的下游分子病理途徑;⑧檢測慢性腦血流低灌注誘導的白質(zhì)損傷區(qū)域前炎性細胞因子表達的變化,以及干預腺苷A2A受體活性對其表達的影響,探討與慢性低灌注白質(zhì)炎性病理損傷有關的信號轉導途徑。
　　方法:
　　1.實驗動物
　　引進腺苷A2A受體基因敲除(A2Areceptorgeneknock-out,A2AR/KO)雜合

6、子小鼠交配繁殖,聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction,PCR)方法鑒定A2AR/KO小鼠和野生型(wild-typelittermates,A2AR/WT)小鼠。
　　2.骨髓移植細胞嵌合模型的建立
　　采用骨髓移植細胞嵌合的方法建立骨髓來源細胞腺苷A2A受體選擇性缺失及選擇性重建模型。即放射線破壞雄性野生型或A2AR/KO小鼠骨髓后,移植雌性A2AR/KO小鼠骨髓細胞至野生型小鼠構建骨髓來源細胞腺苷

7、A2A受體選擇性缺失模型(KO—WT),骨髓細胞移植WT—WT組作為其對照;移植雌性野生型小鼠骨髓細胞至A2AR/KO個鼠構建骨髓來源細胞腺苷A2A受體選擇性重建模型(WT—KO),骨髓細胞移植KO—KO組作為其對照;PCR法檢測雄性受體外周血性染色體及免疫熒光法檢測外周血白細胞A2A受體表達,鑒定骨髓移植細胞嵌合模型是否成功建立。
　　3.慢性腦血流低灌注模型的建立
　　參照Shibata等方法,用內(nèi)徑為0.18mm的微型

8、彈簧圈套雙側頸總動脈建立小鼠慢性腦血流低灌注模型,建模前及建模后2h監(jiān)測腦血流以判斷模型是否成功;建模前及建模后4w,對部分動物行Morris水迷宮實驗,記錄每只動物發(fā)現(xiàn)平臺的平均潛伏期和穿越平臺的次數(shù),以此為指標評價空間學習和記憶能力。
　　4.腺苷A2A受體激動劑干預
　　給予慢性腦血流低灌注野生型小鼠和骨髓來源細胞腺苷A2A受體選擇性重建小鼠腺苷A2A受體激動劑CGS21680(0.25mg/kg,腹膜腔注射,1次/d

9、,直至各組動物觀察終點,即腦缺血后第2w、4w和6w,比較非選擇性激活與選擇性激活骨髓來源細胞腺苷A2A受體對于慢性腦血流低灌注白質(zhì)損傷及炎性病理反應的影響。
　　5.白質(zhì)損傷、小膠質(zhì)細胞增生、炎性因子和CystatinF表達的檢測
　　分別于腦缺血后2w、4w和6w取腦標本,ZO-1免疫組化染色法觀察血腦屏障開放程度,Kluver-Barrera及Bielschowsky染色法評價白質(zhì)損傷,髓鞘堿性蛋白(myelinbas

10、icprotein,MBP)免疫組化染色法觀察髓鞘脫失,比較各組動物血腦屏障和白質(zhì)損傷程度。CDllb免疫組織化學染色方法觀察并計數(shù)白質(zhì)區(qū)域單位面積(0.25ffiff12)小膠質(zhì)細胞活化及增生情況,抗CD3和抗LY6G免疫組化染色方法觀察白質(zhì)區(qū)域外周血液來源的炎性細胞浸潤情況;提取胼胝體mRNA及總蛋白,分別采用實時定量PCR(real-timequantitativePCR,rt-qPCR》和westernblot方法檢測致炎因子I

11、L-1[3、TNF-α、IL-6、IL-12P40以及抗炎因子IL-10的mRNA和蛋白表達;免疫熒光雙標染色觀察CystatinF在腦內(nèi)的表達及細胞定位,rt-qPCR方法檢測其mRNA和蛋白表達;組間比較前述指標以探討選擇性干預骨髓來源和非骨髓來源細胞腺苷A2A受體活性對慢性腦血流低灌注誘導的白質(zhì)炎性病理反應的影響及其可能的信號轉導途徑。
　　結果:
　　1.成功建立骨髓移植細胞嵌合模型
　　(1)骨髓細胞移植前雄

12、性受體小鼠外周血白細胞性染色體為兩條帶,符合雄性染色體特征,而接受雌性小鼠骨髓細胞移植后其外周血白細胞性染色體僅為一條帶,符合雌性染色體特征,表明移植后雄性受體小鼠外周血白細胞來源于雌性供體骨髓細胞。
　　(2)骨髓細胞移植KO-WT組小鼠外周血白細胞A2A受體陽性率(5.28％±1.05%),與KO—KO組(6.62%±2.04%)比較無顯著差異(P>0.05),而顯著低于骨髓細胞移植WT—WT組(92.32%±15.43%)(

13、P<05),表明成功建立骨髓來源細胞A2A受體選擇性缺失模型。
　　(3)骨髓細胞移植WT—KO組小鼠外周血白細胞A2A受體陽性率(96.34%±12.58%),與WT—WT組(92.32%±15.43%)比較無顯著差異(P>0.05),而顯著高于骨髓細胞移植KO—KO組(6.62%±2.04%)Ρ<0.05),表明成功建立骨髓來源細胞A2A受體選擇性重建模型。
　　2.成功建立慢性腦血流低灌注動物模型
　　(1)腦血

14、流監(jiān)測
　　在雙側頸總動脈圈套前及建模后2h分別檢測腦血流量,各模型組動物建模后腦血流量下降40%-50%,組間比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05),表明該方法造成顯著的腦缺血,且各模型組動物腦缺血程度相同。
　　(2)血腦屏障通透性檢測
　　分別于腦缺血后2w、4w和6w,取腦標本ZO-1免疫組化染色,各時間點與假手術組動物比較顯色強度評分均顯著降低(P<0.05),缺血后2w評分最低,此后逐漸升高,但至缺血后6w時仍低

15、于對照水平,表明缺血后2w血腦屏障開放最顯著,缺血后6w時血腦屏障仍處于開放狀態(tài)。
　　骨髓來源細胞腺苷A2A受體選擇性缺失與選擇性重建動物,以及骨髓細胞移植對照組動物,組間比較ZO-1免疫組化染色強度評分無統(tǒng)計學差異(P>0.05);腺苷A2A受體激動劑處理組,包括野生型和骨髓來源細胞腺苷A2A受體選擇性重建動物,以及載體溶液處理的對照組動物,組間比較ZO-1免疫組化染色強度評分無統(tǒng)計學差異(Ρ>0.05);表明腺苷A2A受體介

16、導的效應對慢性腦血流低灌注造成的血腦屏障通透性變化無影響。
　　(3)白質(zhì)損傷的評價
　　分別于腦缺血后2w、4w和6w,取腦標本Kluver-Barrera染色和Bielschowsky銀染評價白質(zhì)纖維損傷,MBP免疫組化染色評價髓鞘脫失,發(fā)現(xiàn)隨著腦缺血時間延長,白質(zhì)損傷逐漸加重。
　　3.干預腺苷A2A受體活性對慢性腦血流低灌注動物認知行為的影響
　　(1)骨髓細胞移植各組動物的認知行為比較
　　骨髓細

17、胞移植各組動物,包括骨髓來源細胞腺苷A2A受體選擇性缺失與選擇性重建動物,以及骨髓細胞移植對照組動物,腦缺血前組間比較Morris水迷宮實驗測定的平均潛伏期及穿越平臺次數(shù)無顯著差異異>0.05),表明骨髓細胞移植對小鼠的空間學習及記憶能力無影響,
　　(2)慢性腦血流低灌注對認知行為的影響
　　慢性腦血流低灌注各組動物,缺血后第4w采集的數(shù)據(jù)分別與其缺血前的數(shù)據(jù)比較,Morris水迷宮實驗測定的平均潛伏期延長及穿越平臺次數(shù)減

18、少(P<0.05),表明腦缺血后動物的空間學習和記憶能力受到損害。
　　(3)骨髓來源細胞腺苷A2A受體選擇性缺失對腦缺血引起的認知損害的影響
　　骨髓細胞移植KO—WT組與WT-WT組比較,腦缺血后第4w,Morris水迷宮實驗測定的平均潛伏期延長(P<0.05),穿越平臺次數(shù)顯著減少(P<0.05),表明骨髓來源細胞腺苷A2A受體的選擇性缺失,不但加重慢性腦血流低灌注造成的空間學習能力障礙,也加重記憶功能損害。
　

19、　(4)骨髓來源細胞腺苷A2A受體選擇性重建對腦缺血引起的認知損害的影響
　　骨髓細胞移植WT—KO組與KO—KO組比較,腦缺血后第4w,Morris水迷宮實驗測定的平均潛伏期顯著縮短(P<0.05),表明骨髓來源細胞腺苷A2A受體的選擇性重建減輕慢性腦血流低灌注造成的空間學習能力損害。
　　4.干預腺苷A2A受體活性對慢性腦血流低灌注白質(zhì)損傷的影響
　　(1)干預整體腺苷A2A受體活性對慢性腦血流低灌注白質(zhì)損傷的影響

20、
　　分別于腦缺血后第2w、4w和6w,取腦標本Kluver-Barrera染色觀察胼胝體神經(jīng)纖維損傷情況,比較發(fā)現(xiàn)腺苷A2A受體基因敲除動物胼胝體損傷較同窩野生型動物明顯加重,而腺苷A2A受體激動劑CGS21680處理動物胼胝體損傷較載體溶液對照動物明顯減輕,表明激活腺苷A2A受體對慢性腦血流低灌注白質(zhì)損傷具有保護效應。
　　(2)選擇性干預骨髓來源細胞腺苷A2A受體活性對慢性腦血流低灌注白質(zhì)損傷的影響分別于腦缺血后第2w

21、、4w和6w,取腦標本Kluver-Barrera和Bielschowsky染色評價白質(zhì)纖維損傷情況,MBP免疫組化染色評價髓鞘脫失情況。骨髓細胞移植KO—WT組與WT—WT組比較,白質(zhì)纖維損傷和髓鞘脫失更嚴重;WT—KO組與KO—KO組相比,白質(zhì)纖維損傷和髓鞘脫失明顯較輕;表明骨髓來源細胞腺苷A2A受體的選擇性缺失加重慢性腦血流低灌注導致的白質(zhì)損傷,骨髓來源細胞腺苷A2A受體介導的效應減輕白質(zhì)損傷。
　　腦缺血后各時間點,骨髓細

22、胞移植KO—WT組與KO—KO組比較白質(zhì)損傷更嚴重;腦缺血后第4w和6w,骨髓細胞移植WT→KO組與WT—WT組相比白質(zhì)損傷較輕;提示非骨髓來源細胞的腺普A2A受體介導的效應對慢性腦血流低灌注導致的白質(zhì)損傷也產(chǎn)生影響，可能加重損傷，但對白質(zhì)損傷結局并不發(fā)揮主導作用。
　　腺普A2A受體激動劑CGS21680處理各組及其載體溶液對照組動物比較，白質(zhì)損傷嚴重程度依次為載體溶液處理的野生型動物、載體溶液處理的骨髓來源細胞腺苷A2A受體選