奶牛Hsp72單克隆抗體的制備.pdf

1、利用DNAStarProtean軟件對GenBank上發(fā)表的奶牛Hsp72完整氨基酸序列的抗原位點進(jìn)行分析,選取其中抗原性較好的區(qū)域,根據(jù)其對應(yīng)的DNA序列設(shè)計一對引物,上下游引物兩端分別有EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點。以從奶牛血中提取的總DNA為模板,用PCR方法擴(kuò)增該基因片段。將擴(kuò)增得到的基因克隆到pMD18-T載體上,構(gòu)建pMD-18T/Hsp72重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α,對經(jīng)藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定出的陽性克隆進(jìn)行序列

2、測定,應(yīng)用BLAST和DNAStar軟件對所測序列進(jìn)行分析。利用內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ酶切pMD-18T/Hsp72重組質(zhì)粒,將切下的目的片段插入pET-32a-c(+)載體,構(gòu)建pET-32a-c(+)/Hsp72重組質(zhì)粒,重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和酶切鑒定為陽性后,轉(zhuǎn)化宿主菌E.coliBL21。利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá),并摸索最佳的誘導(dǎo)條件。通過SDS-PAGE電泳和Westernblotting對重組蛋白進(jìn)行分析和鑒定。利用親和層析提

3、純蛋白,免疫BLAB/C系小鼠。建立檢測奶牛Hsp72抗體的間接ELISA篩選方法,應(yīng)用雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0和經(jīng)重組蛋白（奶牛Hsp72）免疫過的小鼠脾細(xì)胞融合,利用建立的間接ELISA方法對融合細(xì)胞進(jìn)行篩選,選取陽性細(xì)胞應(yīng)用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。試驗結(jié)果如下:
　　 1.用PCR方法成功克隆了541bp的奶牛Hsp72DNA片段(GenBank登錄號為EU038069),經(jīng)BLAST分析,與GenBan

4、k已發(fā)表序列同源性為99.3％,共有2個位點發(fā)生突變,氨基酸序列同源性為100％,蛋白二級結(jié)構(gòu)分析顯示,該蛋白屬于可溶性蛋白,蛋白抗原性好。
　　 2.SDS-PAGE電泳顯示,原核表達(dá)產(chǎn)物的分子質(zhì)量約為37kD,與預(yù)計大小相符,對表達(dá)重組蛋白進(jìn)行可溶性分析,證實該蛋白以包涵體和可溶性兩種形式存在。最佳誘導(dǎo)條件為:0.3mmol/LIPTG,25℃,8h;經(jīng)Westernblotting試驗進(jìn)一步證實,該重組蛋白具有奶牛Hsp7

5、2反應(yīng)原性,命名為“奶牛Hsp72”。
　　 3.間接ELISA最佳反應(yīng)條件為:奶牛Hsp72、商品奶牛Hsp72為包被抗原濃度分別為1.5μg/ml,2.0μg/ml,1％BSA做封閉液。最佳陽性血清稀釋度為1∶1.6×104,StressgenHsp72單克隆抗體的最佳稀釋度為1∶400（2.5μg/ml）,抗原抗體反應(yīng)時間為90min,1％BSA作為封閉液,含0.5％的吐溫-20作為洗滌液。羊抗小鼠IgG-HRP最佳稀釋度