循環(huán)血microRNAs用于急性腦梗死早期診斷的實驗和臨床研究.pdf

1、腦卒中仍是當(dāng)代社會最重要的致死原因之一，許多腦卒中的幸存者都會留有終生的嚴(yán)重殘疾。而缺血性腦卒中占了所有腦卒中的70-85％。目前對急性腦梗死的診斷和預(yù)后判斷主要依靠病史、查體和影像學(xué)檢查。影像學(xué)檢查運用最廣泛的是計算機(jī)體層攝影術(shù)和MRI。但是前者數(shù)小時內(nèi)還無法顯示病灶，后者費用較昂貴，檢查時間較長，部分基層單位沒有開展且容易產(chǎn)生運動偽影。這促使人們尋找更方便、準(zhǔn)確性更高的診斷方法。而想要用一種標(biāo)本監(jiān)測患者在缺血性卒中急性期的腦改變，血

2、液標(biāo)本是最容易獲得的。準(zhǔn)確地預(yù)測腦卒中的預(yù)后對臨床實踐中實施個性化治療是重要的。
　　miRNAs是一種近年發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性非編碼小RNA，它通過與其目標(biāo)mRNA的3'-端非翻譯區(qū)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因的表達(dá)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)血液中的核酸酶并不能破壞循環(huán)血miRNAs。另有研究發(fā)現(xiàn)血液中的miRNAs含量經(jīng)長期儲存、重復(fù)檢測結(jié)果是穩(wěn)定的，并且標(biāo)本經(jīng)反復(fù)凍融后miRNAs無明顯變化。在過去的十年間，逐漸有證據(jù)證明它們在人類疾病中的作用。早期

3、是慢性病，如癌癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎;后期是急性病，如心血管疾病、外傷等。但是，缺血性腦卒中的miRNAs的研究仍處于其早期階段，還存在諸多缺陷。
　　miRNAs是一組具有獨特基因功能的內(nèi)源性核糖核酸調(diào)節(jié)子。它對解釋腦梗死的病理生理過程的潛在機(jī)制顯示了巨大的潛力。它在診斷和預(yù)測腦梗死的預(yù)后方面可能有重要的作用。因此，假設(shè)有特異的循環(huán)血miRNAs差異表達(dá)譜可以提示急性腦梗死的病理生理過程和疾病狀態(tài)，這些循環(huán)血miRNAs中的一部分有可

4、能成為急性腦梗死無創(chuàng)性早期診斷的生物標(biāo)志物并預(yù)測其預(yù)后。
　　本研究的主要目的有二:1、比較急性腦梗死患者與健康志愿者血漿miRNAs芯片的表達(dá)差異;2、探討血漿miRNAs作為急性腦梗死早期生物標(biāo)志物的潛在價值。
　　本研究涉及的主要技術(shù)和方法:血液標(biāo)本的初步處理和儲存，血漿總RNA的抽提，qRT-PCR，血漿miRNAs芯片，醫(yī)學(xué)統(tǒng)計學(xué)。
　　第一部分急性腦梗死循環(huán)血miRNAs芯片表達(dá)譜的變化研究
　　目的

5、:研究健康志愿者的血漿miRNAs含量和分布情況，建立急性腦梗死患者與健康志愿者血漿miRNAs的差異表達(dá)譜。
　　方法:分別采集4例健康志愿者和7例急性腦梗死患者的血漿，以mirVanaPARIS Kit(Applied Biosystem p/n AM1556)提取總RNA，采用Agilent miRNA芯片技術(shù)(19.0version)進(jìn)行質(zhì)檢、熒光標(biāo)記、雜交和掃描。以平均信號值＞2為有效信號，分析健康志愿者的血漿miRNA

6、s表達(dá)譜及急性腦梗死患者與健康志愿者血漿miRNAs的差異表達(dá)譜。
　　結(jié)果:
　　1、利用miRNAs芯片技術(shù)可以檢測出血漿中142條有效miRNAs，其中平均信號強度值小于100的miRNAs有106種，占總有效miRNAs數(shù)的74.6％，大部分血漿miRNAs信號非常微弱。
　　2、除了miR-21-5p（2.87±5.41）以外其余文獻(xiàn)報道的腦組織特異性的miRNAs在本組健康志愿者血漿中檢測不到。
　　

7、3、除miR-122在芯片中具有有效信號值（72.75±145.15）以外，絕大多數(shù)其他組織特異的miRNAs在健康人血漿中檢測不到有效信號。
　　4、除miR-223-3p和miR-16-5p以外，大部分文獻(xiàn)報道的組織特異的miRNAs并沒有在本研究的急性腦梗死患者和健康志愿者血漿miRNAs之間顯示出顯著差異。分析兩組間差異最明顯12個miRNAs:其中11個miRNAs表達(dá)上調(diào)，1個表達(dá)下調(diào)，
　　結(jié)論:通過miRNA

8、s芯片可以檢測血漿中的miRNAs，健康志愿者中大部分血漿miRNAs信號非常微弱;大部分文獻(xiàn)報道的組織特異的miRNAs在健康志愿者血漿中信號微弱，并無法進(jìn)入本研究的急性腦梗死患者和健康志愿者的血漿miRNAs差異表達(dá)譜;我們篩選出兩組間差異最明顯的12個miRNAs作為下一步工作的基礎(chǔ)。
　　第二部分循環(huán)血miRNAs早期診斷急性腦梗死的價值及其與預(yù)后關(guān)系的研究
　　目的:
　　1、在小樣本的急性腦梗死患者和健康對

9、照人群中，評價候選標(biāo)志物診斷急性腦梗死的價值，隨后將慢性腦梗死也納入評價體系之中;
　　2、在小樣本的急性腦梗死患者中，評價候選標(biāo)志物判斷患者預(yù)后的價值。
　　方法:
　　1、采集急性腦梗死患者27例、慢性腦梗死患者28例、健康志愿者26例的血漿，利用qRT-PCR進(jìn)行miRNAs定量分析;
　　2、挑選芯片的差異表達(dá)譜中熒光信號較高的7個miRNAs并結(jié)合文獻(xiàn)挑選1個候選標(biāo)志物，分析其在急性腦梗死患者和健康者之

10、間的差異，并分析其中有診斷價值者在急性、慢性腦梗死患者、健康志愿者之間的差異;
　　3、將急性腦梗死患者分為預(yù)后不佳組(MRS3-6)和預(yù)后良好組(MRS0-2)，挑選在急性患者和健康志愿者之間有差異的miRNAs，進(jìn)一步分析其在兩組之間的差異。
　　結(jié)果:
　　1、急性患者與志愿者二組評價時，急性腦梗死患者血漿中miR-16和let-7i表達(dá)水平較健康志愿者明顯升高，具有顯著性差異，而miR-106b，miR-130

11、a，miR-223，miR-25，miR-140，miR-4454在兩組之間無顯著性差異。三組人群統(tǒng)一評價時，miR-16和let-7i都能區(qū)分急性患者和志愿者，但let-7i能區(qū)分急性和慢性腦梗死患者，而miR-16不能。let-7i對急性腦梗死特異性更強。
　　2、預(yù)后不良組的miR-16和let-7i表達(dá)水平均較預(yù)后良好組顯著升高，兩組之間有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論:來自于芯片差異表達(dá)譜的miR-16和來源于文獻(xiàn)復(fù)習(xí)的l

12、et-7i在急性腦梗死患者和健康志愿者的血漿中有顯著性差異，其中l(wèi)et-7i可以區(qū)分急性和慢性腦梗死。其對急性腦梗死診斷價值更高，可用于排除腦梗死復(fù)發(fā)。miR-16和let-7i在預(yù)后不佳和預(yù)后良好的急性腦梗死患者的血漿之間有顯著性差異。
　　小結(jié):本研究關(guān)注急性腦梗死的早期診斷，結(jié)合miRNAs芯片及熒光定量PCR的最新技術(shù)進(jìn)展，全面分析了健康志愿者的血漿miRNAs表達(dá)譜，急性腦梗死患者和健康志愿者的血漿miRNAs差異表達(dá)譜