姜黃素類似物L(fēng)6H4對(duì)2型糖尿病大鼠肝纖維化的影響.pdf

1、目的:
　　1、觀察姜黃素類似物L(fēng)6H4對(duì)高脂大鼠和2型糖尿病大鼠肝臟功能及形態(tài)的影響。
　　2、觀察姜黃素類似物L(fēng)6H4抑制TIMP-2、MMP-2、TGF-β1蛋白的表達(dá)與延緩2型糖尿病性肝纖維化之間的關(guān)系。
　　方法:
　　本次實(shí)驗(yàn)針對(duì)雄性大鼠，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供60只SD雄性大鼠（體重160g-200g），SPF級(jí)。共隨機(jī)分為五組:正常對(duì)照組（NC組）、高脂組（HF組）、高脂治療組(FT組)、

2、糖尿病組(DM組)，糖尿病治療組(DT組)，具體過(guò)程如下所述。經(jīng)過(guò)普通飼料喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為兩組:正常對(duì)照組8只(NC組，n=8)，實(shí)驗(yàn)組52只(EP組，n=52)。NC組繼續(xù)用普通飼料喂養(yǎng)，EP組大鼠給以高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后，隨機(jī)分成2組:高脂實(shí)驗(yàn)組20只，糖尿病實(shí)驗(yàn)組32只。糖尿病實(shí)驗(yàn)組大鼠一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ，streptozotocin)，劑量為30mg/kg，STZ注射72小時(shí)后尾靜脈采血測(cè)空腹血糖（血糖濃度大

3、于16.7mmol/L時(shí)造模成功），其中，8只大鼠造模失敗被剔除本次實(shí)驗(yàn)。作為對(duì)照，NC組及高脂實(shí)驗(yàn)組大鼠腹腔注射等容積的枸櫞酸緩沖液。同時(shí)將高脂實(shí)驗(yàn)組大鼠隨機(jī)分為2組:高脂組8只（HF組，n=8）、高脂治療組12只（FT組）;糖尿病實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)分2組:糖尿病組(DM組)10只、糖尿病治療組（DT組）14只。后四組繼續(xù)以高脂飼料喂養(yǎng)，F(xiàn)T組及DT組用L6H4灌胃8周，劑量為0.2mg· kg-1·d-1，其余組給以等容積的1％羧甲基纖維素

4、鈉灌胃。喂養(yǎng)過(guò)程中，高脂治療組、糖尿病組、糖尿病治療組分別有4只、2只、6只意外死亡，均剔除本實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，這些大鼠自由飲食飲水，每天稱重一次。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后檢測(cè)以下指標(biāo):(1)各組體重變化;(2)生化指標(biāo)檢測(cè):空腹血糖(FPG)，血胰島素(FIN)，計(jì)算血胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)，血脂TC、TG、LDL-c、HDL-c及LDL-c/HDL-c比值;(3)血清肝功能指標(biāo)檢測(cè):血ALT、ALB;(4)肝臟形態(tài)學(xué)觀察:采用HE染色

5、、油紅O染色和Masson膠原染色法并在光鏡下觀察肝臟形態(tài)學(xué)改變，透射電鏡下觀察其超微結(jié)構(gòu)的改變;(5)免疫組化法檢測(cè):大鼠肝臟TIMP-2、MMP-2、TGF-β1的蛋白表達(dá)水平，采用Image-Pro Plus6.0圖像處理軟件分別測(cè)量累計(jì)吸光度值(IOD)，對(duì)其進(jìn)行定量分析，并對(duì)所得數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1、各組體重比較:
　　與NC組相比，HF組大鼠體重明顯增加(P＜0.01)，DM組大鼠體重明

6、顯下降(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;經(jīng)L6H4干預(yù)治療后，F(xiàn)T組、DT組大鼠比HF組、DM組體重明顯升高(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2、血FPG、FINs、HOMA-IR水平:
　　與NC組相比較，HF組、DM組FPG、HOMA-IR、FINs水平均明顯升高（P＜0.01）;經(jīng)L6H4干預(yù)后，DT組大鼠的FPG、FINs、HOMA-IR均明顯降低（P＜0.01），F(xiàn)T組大鼠FINs水平降低（P＜0.05）

7、，F(xiàn)PG、HOMA-IR明顯降低（P＜0.01）。
　　3、血脂TC、TG、LDL-c、HDL-c及LDL-c/HDL-c比值:
　　與NC組比較，DM、HF組血漿TG、TC、LDL-c、LDL-c/HDL-c比值水平顯著升高（P＜0.01），HDL-c水平明顯降低（P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;經(jīng)L6H4干預(yù)后，F(xiàn)T組、DT組大鼠TG、TC、LDL-c、LDL-c/HDL-c比值水平顯著降低（P＜0.01），F(xiàn)T組HD

8、L-c水平升高（P＜0.05），DM組HDL-c水平明顯升高（P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4、血清肝功能的檢測(cè)
　　與NC組對(duì)照，HF組、DM組大鼠血清ALT明顯升高(P＜0.01)，ALB水平顯著下降(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;經(jīng)L6H4干預(yù)后，F(xiàn)T組、DT組大鼠ALT水平明顯降低(P＜0.01)，F(xiàn)T組ALB水平升高(P＜0.05)，DM組ALB水平明顯升高(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

9、　　5、肝臟形態(tài)學(xué)觀察:
　　5.1光鏡觀察:
　　(1) HE染色:與NC組相比，HF組肝細(xì)胞脂肪變性，細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不等的脂滴，伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn);DM組肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，肝細(xì)胞部分壞死，脂肪變性更加明顯，纖維間隔增厚，匯管區(qū)的膠原纖維增生包繞周圍細(xì)胞，伴有多灶區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);L6H4干預(yù)后，相應(yīng)治療組肝臟組織病變有所減輕。
　　(2)油紅O染色:與NC組大鼠肝臟相比，HF組、DM組大鼠見肝細(xì)胞胞漿不同程度著色紅染

10、，脂滴分布密集;L6H4治療后，相應(yīng)治療組肝細(xì)胞紅染程度明顯減輕。
　　(3) Masson染色:與NC組相比，HF組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)尚且較為完整，肝細(xì)胞脂肪變性，有少量膠原纖維形成，但無(wú)明顯纖維化形成;DM組肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞索排列紊亂，肝細(xì)胞脂肪變性，肝臟纖維組織增生明顯，匯管區(qū)可見粗大的膠原纖維，實(shí)質(zhì)細(xì)胞間也可見亮綠色纖維條索。L6H4干預(yù)后，相應(yīng)治療組亮綠色陽(yáng)性基質(zhì)有所減少。
　　5.2電鏡觀察:
　　與NC

11、組相比，HF組及DM組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)顆粒形成，大小不一，部分相互融合成巨大脂滴，核固縮，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多，線粒體腫脹，密度升高。L6H4干預(yù)后，相應(yīng)治療組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)顆粒數(shù)量減少，核固縮減輕，線粒體增多，腫脹明顯減輕，板狀嵴清晰。
　　6、大鼠肝臟TIMP-2、MMP-2、TGF-β1蛋白表達(dá)的觀察:
　　與NC組相比，DM組、HF組大鼠可見肝組織內(nèi)TGFβ1、TIMP-2表達(dá)明顯增加;L6H4干預(yù)后，F(xiàn)T、DT組大鼠T

12、GFβ1、TIMP-2表達(dá)量明顯減少。
　　與NC組相比，HF組、DM組中MMP-2蛋白表達(dá)明顯降低;經(jīng)L6H4干預(yù)后，F(xiàn)T、DT組MMP-2陽(yáng)性表達(dá)明顯升高。
　　結(jié)論:
　　1、L6H4可降低高脂和2型糖尿病大鼠的血糖、血脂、血胰島素水平，改善其糖脂代謝和胰島素抵抗。
　　2、L6H4可改善高脂和2型糖尿病大鼠肝臟形態(tài)學(xué)改變。
　　3、高脂和2型糖尿病大鼠TIMP-2、TGF-β1蛋白表達(dá)程度升高、MM