姜黃素對(duì)大鼠肺纖維化防治作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是指由多種病因引起的具有相似病理過(guò)程的一類彌漫性肺間質(zhì)疾病，其病理特征是早期有肺泡結(jié)構(gòu)破壞和彌漫性肺泡炎，繼后出現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積，并逐漸演變?yōu)閺浡苑伍g質(zhì)纖維化，從而造成肺功能障礙，病人多死于進(jìn)行性加重的肺纖維化所致的呼吸衰竭。由于發(fā)病率逐年增加，發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，缺乏有效的治療藥物，死亡率高。傳統(tǒng)的糖皮質(zhì)激素和細(xì)胞毒藥物療效不能令人滿意。故尋找行之有效的治療藥物是目前醫(yī)療界

2、迫切需要解決的問(wèn)題。 最近研究表明，姜黃素具有廣泛的藥理作用，如抗炎、抗氧化、抗缺血、抗癌和抗肝纖維化等。為了探討姜黃素對(duì)大鼠肺纖維化的防治作用，本實(shí)驗(yàn)采用博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化模型，從整體、細(xì)胞與分子水平研究其防治肺纖維化的療效和作用機(jī)制，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 研究方法及結(jié)果: 1.整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 1.1方法:SD雄性大鼠144只，體重(198±7)g，分為假手術(shù)組，模型組，姜黃素高、中、低劑量組

3、，醋酸潑尼松組，每組24只，共6組。除假手術(shù)組外其余各組大鼠氣管內(nèi)一次性滴注鹽酸博萊霉素，假手術(shù)組大鼠氣管內(nèi)一次性滴注等體積的生理鹽水。造模后第1天開(kāi)始灌胃給藥，持續(xù)到處死動(dòng)物的前一天。姜黃素高、中、低劑量組分別為200、100、50mg·kg<'-1>·d<'-1>，醋酸潑尼松組(陽(yáng)性藥物對(duì)照組)劑量為0.56 mg·kg<'-1>·d<'-1>，假手術(shù)組，模型組分別灌服等體積的生理鹽水。各組動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)第7，14，28d分三批處死，每

4、組6只常規(guī)制成光鏡標(biāo)本，HE和Mallory染色，2只麻醉后快速開(kāi)胸取肺組織，迅速投入液氮冷凍，以備免疫組化、western blot以及電鏡標(biāo)本的制作。免疫組化載玻片用DEPC處理后備用。普通透射電鏡標(biāo)本常規(guī)制作。釘紅特殊染色透射電鏡標(biāo)本的制作，使用釕紅前固定液和后固定液特殊固定處理，其余包埋，超薄切片制作同透射電鏡。將肺組織分為無(wú)染色區(qū)、深染色區(qū)和淺染色區(qū)，計(jì)算機(jī)圖像分析，采用美國(guó)Image-Pro Plus 5.0圖像分析系統(tǒng)，自

5、動(dòng)測(cè)出各部分所占面積，取其平均值(mm<'2>)，用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 1.2結(jié)果:HE染色結(jié)果：7d、14d、28d時(shí)假手術(shù)組腫組織結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常。7d時(shí)，模型組大鼠肺毛細(xì)血管充血，肺泡隔增寬且水腫，有大量中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞浸澗，可見(jiàn)散在的位于肺問(wèn)隔和細(xì)小支氣管周圍的纖維增生灶；醋酸潑尼松組肺泡腔有炎性細(xì)胞滲出，可見(jiàn)胸膜有滲出和增厚，其余各組未見(jiàn)此變化；姜黃素高、中、低劑量組都表現(xiàn)出不同程度的炎癥。14d

6、時(shí)除模型組外各組炎癥減輕和出現(xiàn)不同程度的纖維化灶。28d時(shí)，各組炎癥明顯消退，個(gè)別區(qū)域仍有極少量炎癥細(xì)胞存留。模型組大鼠纖維化程度明顯，有大片實(shí)變區(qū)，呈中重度肺纖維化改變，表明動(dòng)物模型復(fù)制成功。陽(yáng)性藥物組情況略好，肺泡隔部分纖維化。姜黃素高、中、低劑量組情況明顯好轉(zhuǎn)，肺泡隔纖維增生灶較少，肺泡內(nèi)未見(jiàn)明顯的炎性細(xì)胞。細(xì)小支氣管周圍的纖維化程度明顯低于模型組及醋酸潑尼松組，其中姜黃素高、中劑量組更輕，以中劑量組效果最佳，僅存有極少量的小纖維

7、灶，肺泡結(jié)構(gòu)已經(jīng)基本修復(fù)。表明姜黃素在一定程度上有減輕大鼠肺損傷性肺泡炎或阻抑肺纖維化的作用。Mallory染色結(jié)果證實(shí)：姜黃素高、中、低劑量組在14d和28d時(shí)肺泡隔增生不明顯，纖維化程度輕微。特別是中劑量組病變程度較輕，纖維化程度輕，膠原總含量明顯少。 形態(tài)定量分析結(jié)果顯示：模型組與假手術(shù)組相比，形態(tài)定量分析結(jié)果與組織病理學(xué)檢查一致。姜黃素中、低劑量組在7d時(shí)有一定的抗炎作用，14d、28d時(shí)有明顯抑制鹽酸博萊霉素所致大鼠肺

8、纖維形成作用，中劑量組效果最佳(p<0.01)。 超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)：姜黃素各組肺組織結(jié)構(gòu)較模型組完整，大部分上皮細(xì)胞的基膜完整，成纖維細(xì)胞增生、間質(zhì)膠原纖維沉積范圍及程度均較模型組減輕。 用western-blot和免疫組化的方法，研究姜黃素對(duì)肺組織TNF-α的影響。結(jié)果顯示：姜黃素能降低肺纖維化大鼠肺組織TNF-α的含量。 對(duì)肺外因素——循環(huán)纖維細(xì)胞(circulating fibrocyte)的初步研究

9、 采用免疫組化雙標(biāo)法觀察大鼠肺組織內(nèi)CD45和col Ⅰ的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：博來(lái)霉素組肺纖維化灶內(nèi)的循環(huán)纖維細(xì)胞明顯比正常對(duì)照組數(shù)量多，表明循環(huán)纖維細(xì)胞在博萊霉素誘導(dǎo)大鼠所致腫纖維化形成過(guò)程中起重要作用。 2. 體外實(shí)驗(yàn)研究 2．1方法:建立肺纖維化模型同前，采用組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng)肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞，反復(fù)貼壁純化。以傳代5-8代的成纖維細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，直接觀察不同濃度的姜黃素(10、20、40、80、160μmol/L)

10、觀察姜黃素對(duì)大鼠腫成纖維細(xì)胞(LFb)增殖及分泌細(xì)胞外基質(zhì)的影響。MTT法檢測(cè)姜黃素對(duì)肺成纖維細(xì)胞增殖的影響，ELLIsA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中膠原Ⅰ、透明質(zhì)酸，層粘連蛋白和纖維粘連蛋白的含量。 2．2結(jié)果:姜黃素在(10-160)μmol/L濃度范圍內(nèi)，對(duì)腫成纖維細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性作用，卻劑量依賴地抑制肺成纖維細(xì)胞的增殖，并不同程度抑制Ⅰ型膠原、透明質(zhì)酸、層粘連蛋白和纖維粘連蛋白的分泌，尤以80μmol/L姜黃素效果最好。

11、結(jié)論: 1. 姜黃素能降低博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化細(xì)胞外基質(zhì)的含量，減輕纖維化的程度，從而發(fā)揮預(yù)防和治療肺纖維化的作用。 2. 姜黃素能抑制博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化肺泡細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中TNF-α蛋白活性，從而減輕肺組織炎癥反應(yīng)，減少纖維的集聚和纖維化形成。 3. 肺成纖維細(xì)胞是肺纖維化發(fā)生與發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，姜黃素在體外能顯著抑制成纖維細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的合成，從而起到抗肺纖維化的作用。 4. 骨髓