通過敲除TAP1及TAPBP基因產(chǎn)生低免疫原性的人類胚胎干細(xì)胞.pdf

1、人類胚胎干細(xì)胞在1998年首次從早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離出來，可以在體外進(jìn)行無限的自我更新并保持分化成三胚層所有細(xì)胞形式的多能性，由于這種特性胚胎干細(xì)胞被認(rèn)為是一種對(duì)于細(xì)胞治療很有前景的資源。然而它的應(yīng)用缺面臨著一系列移植免疫排斥的問題。而表達(dá)在細(xì)胞表面的一類主要組織相容性復(fù)合體(MHCⅠ)是引起抑制免疫排斥的主要原因?？乖庸は嚓P(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)子1(Transporter associated with antigenpresentation1,

2、TAP1)和TAP相關(guān)糖蛋白（TAP-associated glycoprotein，TAPBP）在調(diào)控MHCⅠ的表達(dá)過程中起重要作用。本文通過轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶(TALEN)技術(shù)分別產(chǎn)生TAP1和TAPBP缺失的人類胚胎干細(xì)胞。這些細(xì)胞具有正常的多能性，核型及分化能力，但是和野生型比較，MHCⅠ在這些細(xì)胞表面的表達(dá)及免疫原性都明顯降低。本研究為將來的移植治療提供了一種通用的具有多能性的低免疫原性供體細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。
　　實(shí)

3、驗(yàn)結(jié)果：
　　1.產(chǎn)生TAP1基因敲除的人類胚胎干細(xì)胞系，并驗(yàn)證其免疫原性降低，同時(shí)具有同野生型一樣的多能性及分化能力。將特異性識(shí)別TAP1的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶轉(zhuǎn)入人類胚胎干細(xì)胞中，藥殺篩選后，得到3個(gè)單敲細(xì)胞系，5個(gè)雙敲細(xì)胞系，在細(xì)胞水平的打靶效率為27.1％，以雙等位基因敲除的細(xì)胞系TAP1-16，單等位基因敲除細(xì)胞系TAP1-13，通過免疫染色、RT-PCR、畸胎瘤等方法驗(yàn)證其多能性完整，并利用檢測(cè)MHCⅠ在其細(xì)胞表

4、面的表達(dá)比野生型有大幅度降低，IFN-γ誘導(dǎo)后上調(diào)幅度很小，通過小鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)發(fā)現(xiàn)TAP1-13及TAP1-16細(xì)胞系引起的T淋巴細(xì)胞和自然殺傷性淋巴細(xì)胞總數(shù)相較于野生型有顯著性降低。
　　2.產(chǎn)生TAPBP基因敲除的人類胚胎干細(xì)胞系，并驗(yàn)證其免疫原性降低，同時(shí)具有同野生型一樣的多能性及分化能力。將特異性識(shí)別TAPBP的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶轉(zhuǎn)入人類胚胎干細(xì)胞中，藥殺篩選后，得到12個(gè)單敲細(xì)胞系，5個(gè)雙敲細(xì)胞系，在細(xì)胞水平