睪丸支持細(xì)胞對(duì)胚胎干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞團(tuán)分化過(guò)程中不同分化階段細(xì)胞的免疫原性影響.pdf

1、目的:
　　觀察睪丸支持細(xì)胞與不同分化階段的胚胎干細(xì)胞共培養(yǎng)條件下，胚胎干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化的不同階段細(xì)胞的MHC分子、FAS-L分子表達(dá)的情況，以明確睪丸支持細(xì)胞對(duì)胚胎干細(xì)胞向成熟細(xì)胞分化過(guò)程中胚胎干細(xì)胞免疫原性的影響，力圖尋求一種能降低胚胎干細(xì)胞源性成熟細(xì)胞的免疫原性、誘導(dǎo)宿主免疫耐受的方法來(lái)，為糖尿病細(xì)胞移植治療的抗移植排斥策略的制定提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1.睪丸支持細(xì)胞的制備:取一個(gè)月的雄

2、性昆明小鼠的睪丸組織，經(jīng)Ⅰ型膠原蛋白和胰蛋白酶消化成細(xì)胞懸液，離心收集細(xì)胞，接種于含15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。經(jīng)低滲處理去除生精細(xì)胞后可得到純度接近90％的睪丸支持細(xì)胞。睪丸支持細(xì)胞形態(tài)、由HE染色和油紅O染色鑒定。
　　2.MEF的制備:取孕13.5d的小鼠的胚胎，去除頭尾、內(nèi)臟和四肢后用PBS清洗，充分剪碎(1-3mm3)后再用0.25％胰酶(Trypsin)-0.02％EDTA溶液分“3-階段”消化成細(xì)胞懸液，離心收

3、集細(xì)胞，傳代純化后備用。
　　3.ESC的擴(kuò)增:小鼠胚胎干細(xì)胞(ESC)接種于經(jīng)絲裂霉素處理1h后的MEF飼養(yǎng)層上，加入ESC培養(yǎng)液(15％胎牛血清，1000IU/mL白血病抑制因子(LIF)和DMEM高糖培養(yǎng)液），每天換液1次，連續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增3-4d按1∶3-4比例傳代擴(kuò)增。
　　4.ESC向IPC分化誘導(dǎo):采用本實(shí)驗(yàn)室傳統(tǒng)的分階段誘導(dǎo)法。實(shí)驗(yàn)組由睪丸支持細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞分化得到的擬胚體(EB)共培養(yǎng)，然后進(jìn)行向胰島素分泌細(xì)

4、胞分化的定向誘導(dǎo);對(duì)照組不接種睪丸支持細(xì)胞。另外設(shè)置一組睪丸支持細(xì)胞對(duì)照組。具體方法見(jiàn)下:
　　4.1擬胚體(embryonic bodies，EB)的形成:將培養(yǎng)4-5d的ESC用0.25％胰酶(Trypsin)-0.02％EDTA消化為單細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，接種于低粘附性的細(xì)菌培養(yǎng)皿中，添加含有15％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，懸浮培養(yǎng)4-5d，使ESC自發(fā)分化為EB。
　　4.2 nestin陽(yáng)性細(xì)胞(nestin

5、positive cells，NPC)的形成:收集培養(yǎng)4-5d的EB，轉(zhuǎn)種于預(yù)先用Ⅰ型膠原蛋白包被并接種有不同濃度睪丸支持細(xì)胞過(guò)的6-孔培養(yǎng)板，先用只含有15％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h，待EB貼壁后更換為含N2、纖維連接蛋白和bFGF因子的無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)2-3d可形成上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞樣NPC。NPC經(jīng)nestin免疫組化染色鑒定。
　　5.ESC向IPC分化各階段細(xì)胞的MHC-Ⅰ、

6、MHC-Ⅱ和FAS-L分子檢測(cè):實(shí)驗(yàn)組（共培養(yǎng)組）、對(duì)照組（無(wú)支持細(xì)胞）的EB、NPC、 IPC分化階段和睪丸支持細(xì)胞對(duì)照組細(xì)胞，分別用MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、Fas-L抗體處理后進(jìn)行流式細(xì)胞儀(FCM)分析，檢測(cè)各自分子的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)24h后，貼壁生長(zhǎng)，經(jīng)低滲處理可去除生精細(xì)胞，3-4d后，呈多邊形或不規(guī)則形，突起粗大。胞質(zhì)內(nèi)有小顆粒狀物質(zhì)。細(xì)胞核大而明顯，位于胞體中央，有多個(gè)核仁。經(jīng)H

7、E染色、油紅0染色確認(rèn)為睪丸支持細(xì)胞。培養(yǎng)1周，其純度達(dá)到90％以上。
　　2.用13.5d的孕小鼠胚胎制備出的原代MEF，在懸浮狀態(tài)下呈圓形。培養(yǎng)24h后，大部分細(xì)胞貼壁，呈上皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞樣，可混雜有少量其他細(xì)胞。傳代純化后的MEF形態(tài)為長(zhǎng)梭形纖維細(xì)胞樣，不含雜細(xì)胞。
　　3.ESC接種24h后可貼壁生長(zhǎng)。3-4d形成致密圓形或橢圓形的ESC集落。
　　4.ESC脫離分化抑制因素后，懸浮培養(yǎng)4-5d可自發(fā)分化、

8、增殖，形成團(tuán)狀的EB。EB在NPC誘導(dǎo)培養(yǎng)基中貼壁生長(zhǎng)。繼續(xù)誘導(dǎo)3-4d可形成了上皮樣細(xì)胞的NPCs。再在IPC誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)6d后可形成為胰島樣細(xì)胞團(tuán)(ICCs)。
　　5.FCM分別檢測(cè)EB、NPC和ICCs的MHC、FasL分子表達(dá)，結(jié)果顯示，在在沒(méi)有睪丸支持細(xì)胞的情況下，F(xiàn)as-L分子表達(dá)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低;MHC-Ⅰ分子、MHC-Ⅱ分子表達(dá)則呈上升趨勢(shì)。當(dāng)與每毫升104、105、106濃度的睪丸支持細(xì)胞共培

9、養(yǎng)時(shí)，不同分化階段細(xì)胞的Fas-L、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子表達(dá)均呈逐漸降低趨勢(shì)。
　　6.在預(yù)先有睪丸支持細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的基礎(chǔ)上接種EB，貼壁良好，不易脫落，不需要Ⅰ型膠原蛋白處理。
　　結(jié)論:
　　1.本實(shí)驗(yàn)采用睪丸支持細(xì)胞和EB共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化的方法，在18d左右的時(shí)間內(nèi)可獲得具有胰島樣結(jié)構(gòu)的IPC，可見(jiàn)睪丸支持細(xì)胞不影響其誘導(dǎo)過(guò)程
　　2.在沒(méi)有睪丸支持細(xì)胞共培養(yǎng)的條件下，EB、NPC和ICCs的免疫原性是