PDGF-D和JAK-STAT信號(hào)通路在IgA腎病發(fā)病中的作用以及雷帕霉素對(duì)IgA腎病的影響.pdf

1、目的：IgA腎病(IgA nephropathy,IgAN)是目前世界上最常見的慢性進(jìn)行性的原發(fā)性腎小球疾病。其主要病理特征是IgA免疫復(fù)合物在系膜區(qū)沉積，導(dǎo)致系膜細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，引起一系列臨床及病理生理改變，是導(dǎo)致終末期腎病(ESRD)的主要原因之一。隨著腎臟活組織穿刺技術(shù)的逐漸推廣，兒童IgA腎病的診斷率也在逐年提高，而有關(guān)IgA腎病的發(fā)病機(jī)制則是目前眾學(xué)者研究的熱點(diǎn)。本研究以IgA腎病患兒、IgA動(dòng)物模型以及PDGF

2、-D培養(yǎng)的系膜細(xì)胞為對(duì)象，采用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，從整體、細(xì)胞和分子等不同水平檢測IgA腎病腎小球細(xì)胞JAK/STAT信號(hào)途徑的變化以及PDGF-D在IgA腎病發(fā)病過程中的動(dòng)態(tài)變化，同時(shí)還觀察了雷帕霉素對(duì)IgA腎病的作用及影響。 方法： 1.IgA腎病兒童PDGF-D和JAK/STAT信號(hào)蛋白的檢測 標(biāo)本均來自2004年1月～2007年10月在我科住院并行腎活檢確診的52例IgA腎病患兒，其中男29例，女23例；年齡5

3、～16歲，平均(10.7±3.1)歲。實(shí)驗(yàn)分四組：對(duì)照組16例；輕度增生組17例(Hass Ⅰ、Ⅱ型)；局灶增生組18例(HassⅢ型)；增生硬化組17例(HassⅣ、Ⅴ型)。正常對(duì)照組兒童32例，其中16例來自我院兒保門診健康查體的兒童，無各種原發(fā)及繼發(fā)性腎臟疾患，16例腎組織標(biāo)本均取自腎臟疾病術(shù)后病理檢查正常的患兒。ELISA法檢測IgA腎病患兒血、尿PDGF-D和PDGF-B水平，免疫組織化學(xué)染色法檢測PDGF-D、PDGF-B、

4、PDGFR-β、STAT3、p-STAT3、P-JAK2、SOCS1和SOCS3蛋白表達(dá)。 2.大鼠IgA腎病模型的制備和PDGF-D及JAK/STAT信號(hào)蛋白的檢測 Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和IgA腎病組，IgA腎病模型制備：隔日牛血清白蛋白400mg·kg-1·d-1灌胃，持續(xù)6周，皮下注射蓖麻油0.5ml+四氯化碳0.1ml，每周一次，持續(xù)9周，脂多糖分別于第6、8周以0.05mg尾靜脈注射，觀察至1

5、0周末。將腎皮質(zhì)組織切成3μm的冰凍切片，采用兔抗大鼠IgA和FITC標(biāo)記羊抗兔IgG間接免疫熒光染色，熒光顯微鏡下觀察腎小球系膜區(qū)IgA沉積陽性，PASM和Masson染色顯示系膜細(xì)胞增生和系膜基質(zhì)的沉積表明造模成功，成功率為90％。分別于成模后1、2、4、8周每組取7只大鼠，切取腎臟。取部分腎組織置于4％多聚甲醛固定用于光鏡觀察及免疫組化檢測：部分腎皮質(zhì)組織用于提取腎組織總RNA和腎組織總蛋白。免疫組織化學(xué)染色法和Western b

6、lot檢測腎組織PDGF-D、PDGF-B、PDGFR-β、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS1和SOCS3蛋白表達(dá)；半定量RT-PCR檢測腎組織PDGF-D mRNA、PDGF-BmRNA、STAT3 mRNA、SOCS1 mRNA和SOCS3 mRNA表達(dá)。 3.PDGF-DD對(duì)體外培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞JAK/STAT信號(hào)途徑的影響 取人系膜細(xì)胞株，用無血清RPMI1640培養(yǎng)液洗一次，換無血清RP

7、MI1640培養(yǎng)液孵育24h，使細(xì)胞同步化。用MTT法觀察不同時(shí)間(6、12、24、48h)和不同濃度(0、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml)PDGF-DD對(duì)細(xì)胞增殖狀態(tài)的影響。同時(shí)觀察JAK2激酶特異抑制劑AG490對(duì)PDGF-DD條件下細(xì)胞增殖的影響。將細(xì)胞分成3組：對(duì)照組；PDGF-DD刺激組(20ng/ml)和PDGF-DD+AG490組(20ng/ml PDGF-DD+10μmol/LAG490)。

8、分別在24孔板和25cm2塑料培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。于刺激的0、30min、60min、120min和240min收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白、RNA。采用免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot檢測p-JAK2、STAT3、P-STAT3、SOCS1和SOCS3等的表達(dá)；半定量RT-PCR檢測細(xì)胞SOCS1 mRNA和SOCS3 mRNA的表達(dá)。 4.雷帕霉素對(duì)IgA腎病大鼠和體外培養(yǎng)系膜細(xì)胞和JAK/STAT信號(hào)途徑的影響 IgA

9、腎病大鼠隨機(jī)分成5組：正常對(duì)照組、IgA腎病組和雷帕霉素不同劑量組(0.5mg·kg-1·d-1、1mg·kg-1·d-1、2 mg·kg-1·d-1)。于治療后4周收集血、尿和腎組織。部分腎組織經(jīng)4％多聚甲醛固定、石蠟包埋，用于形態(tài)學(xué)觀察和免疫組化。應(yīng)用免疫組化、Western blot以及RT-PCR等方法，觀察雷帕霉素對(duì)IgA腎病大鼠腎組織p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS1和SOCS3蛋白及STAT3 mRNA、

10、SOCS1 mRNA和SOCS3 mRNA表達(dá)的影響。 取人系膜細(xì)胞株種植于96孔板，采用MTT法分別檢測對(duì)照組、PDGF-DD刺激組以及干預(yù)藥物雷帕霉素在不同時(shí)間、不同藥物濃度對(duì)系膜細(xì)胞增殖狀態(tài)的影響。采用25cm2塑料培養(yǎng)瓶培養(yǎng)細(xì)胞，將細(xì)胞分成3組：對(duì)照組；PDGF-DD刺激組(20ng/ml)；PDGF-DD+RPM組(20ng/mlPDGF-DD+20μg/ml RPM)。于刺激的24h收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白和RNA。

11、采用Western blot檢測p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS1、SOCS3的表達(dá)；半定量RT-PCR檢測細(xì)胞SOCS1 mRNA和SOCS3 mRNA的表達(dá)。 結(jié)果： 1.JAK/STAT信號(hào)蛋白在IgA腎病人體、大鼠腎組織及系膜細(xì)胞中的表達(dá) 人體實(shí)驗(yàn)結(jié)果：免疫組化顯示正常對(duì)照組STAT3在腎小球系膜區(qū)和腎小管呈灶狀微量表達(dá)，其中個(gè)別。腎小管可見p-STAT3表達(dá)；STAT3和p-STAT3

12、在IgA腎病各組腎小球系膜區(qū)和腎小管的表達(dá)增加，p-STAT3的活化程度隨病變程度的加重而逐漸增加，各病變組與對(duì)照組相比均有顯著差異。SOCS1和SOCS3在正常對(duì)照組腎小球無明顯表達(dá)，在IgA腎病組呈陽性表達(dá)。與正常對(duì)照組相比，IgA腎病各組患兒隨著腎小球病變程度的加重，SOCS1和SOCS3的陽性率呈逐漸增高趨勢。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果：①光鏡下觀察，IgA腎病組大鼠在成模后4周內(nèi)腎小球均未見明顯增大，到第8周時(shí)腎小球體積有輕度增大

13、，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②免疫組化顯示STAT3、p-STAT3、SOCS1和SOCS3在對(duì)照組和IgA腎病組大鼠腎組織中均有陽性表達(dá)。STAT3在細(xì)胞漿和細(xì)胞核均有表達(dá)，p-STAT3主要在細(xì)胞核表達(dá)，SOCS1和SOCS3主要在細(xì)胞漿表達(dá)。主要分布在腎小球系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞。與同期對(duì)照組相比，IgA腎病大鼠腎組織中STAT3、p-STAT3、SOCS1和SOCS3均從第1周表達(dá)開始增高，第2周時(shí)達(dá)到高峰，第4周至第8周時(shí)表

14、達(dá)有所下降，但明顯高于相應(yīng)對(duì)照組。③Western blot顯示，p-JAK2自IgA腎病第1周起表達(dá)開始增高，隨時(shí)間延長而逐漸增高；腎組織STAT3、p-STAT3和SOCS1蛋白水平自IgA腎病成模后第1周起表達(dá)開始增加，在第2周時(shí)表達(dá)水平最高，第4周至第8周時(shí)表達(dá)水平開始有所下降，但仍明顯高于對(duì)照組；SOCS3蛋白水平自IgA腎病成模后第2周起表達(dá)開始增加，在第4周時(shí)表達(dá)水平最高，第8周時(shí)表達(dá)水平開始有所下降，但仍明顯高于對(duì)照組。

15、④半定量RT-PCR結(jié)果顯示，STAT3 mRNA、SOCS1 mRNA和SOCS3 mRNA在對(duì)照組腎小球有少量基礎(chǔ)表達(dá)，不同時(shí)間表達(dá)無差異。IgA腎病組自成模后第1周起STAT3 mRNA和SOCS1 mRNA表達(dá)開始增加，隨著時(shí)間延長，其表達(dá)也逐漸增加，于第2周表達(dá)最高，第4周到第8周出現(xiàn)回落，但仍高于對(duì)照組。SOCS3 mRNA從第2周起表達(dá)開始增加，于第4周達(dá)到高峰，第8周開始出現(xiàn)回落。 2.PDGF-D、PDGF-B

16、和PDGFR-β在IgA腎病人體及大鼠腎組織中的表達(dá) 3.雷帕霉素對(duì)IgA腎病大鼠和體外培養(yǎng)系膜細(xì)胞JAK/STAT信號(hào)途徑的影響 結(jié)論：①IgA腎病患者和IgA腎病模型動(dòng)物。腎組織細(xì)胞信號(hào)蛋白p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS1、SOCS3和PDGF-D表達(dá)均明顯升高，STAT3、SOCS1、SOCS3和PDGF-D mRNA亦明顯上調(diào)，表明PDGF-D和JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能參與了IgA腎病

17、的發(fā)病過程。②PDGF-DD能夠活化體外培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞JAK/STAT信號(hào)途徑，使信號(hào)蛋白JAK2和STAT3的磷酸化增強(qiáng)，SOCS1和SOCS3蛋白及mRNA的表達(dá)增加。JAK2特異性抑制劑AG490能夠降低PDGF-DD刺激引起的系膜細(xì)胞p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS1和SOCS3蛋白及mRNA的表達(dá)，提示PDGF-D可能通過激活JAK/STAT信號(hào)途徑參與了IgA腎病的發(fā)病過程。③雷帕霉素治療能夠明顯抑

18、制IgA腎病大鼠腎組織JAK/STAT信號(hào)蛋白的表達(dá)，使大鼠的血、尿生化指標(biāo)明顯緩解：雷帕霉素能夠抑制PDGF-DD刺激引起的系膜細(xì)胞JAK/STAT信號(hào)途徑的活化，提示其腎臟保護(hù)作用可能部分是通過影響JAK/STAT信號(hào)途徑活化實(shí)現(xiàn)的。雷帕霉素有望成為臨床治療IgA腎病患者的有效藥物。④PDGF-D中和抗體及PDGF-D受體拮抗劑可能成為臨床治療IgA腎病的新趨勢。JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑可能成為臨床治療IgA腎病患者的新途徑。