Aquaporin-4基因敲除對(duì)氟西汀促神經(jīng)再生的影響.pdf

1、Aquaporin-4基因敲除對(duì)氟西汀促海馬神經(jīng)再生的影響水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一類廣泛存在于真核生物細(xì)胞膜上、選擇性高效轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的特異孔道，對(duì)機(jī)體的水液平衡和細(xì)胞微環(huán)境的穩(wěn)定發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。其中，水通道蛋白4(aquaporin-4， AOP4)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)最豐富的水通道蛋白，主要表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞上，與腦損傷、腦腫瘤及腦缺血的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系。星形膠質(zhì)細(xì)胞廣泛參與腦內(nèi)神經(jīng)發(fā)生的各個(gè)環(huán)節(jié)。它不僅

2、能夠支持神經(jīng)元的存活，導(dǎo)向神經(jīng)元的遷移，調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，調(diào)節(jié)突觸的形成及其功能，還能在體外發(fā)育成多潛能的、自我更新的神經(jīng)球。而新近的研究表明星形膠質(zhì)細(xì)胞家系成員--神經(jīng)干細(xì)胞上也表達(dá)有豐富的AQP4，而神經(jīng)干細(xì)胞更是腦內(nèi)神經(jīng)再生的直接參與者。這些研究結(jié)果提示AQP4不僅是腦內(nèi)一種特異性的水轉(zhuǎn)運(yùn)孔道，而且可能在神經(jīng)再生的調(diào)節(jié)中具有重要的作用。 神經(jīng)再生(neurogenesis)是指由神經(jīng)干細(xì)胞生成功能性神經(jīng)元的過(guò)程，包括神

3、經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化、成熟及向神經(jīng)回路整合四個(gè)步驟。在大多數(shù)哺乳動(dòng)物以及人類的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，成體神經(jīng)再生主要位于側(cè)腦室下區(qū)(subventricular zone，SVZ)和海馬齒狀回亞顆粒細(xì)胞區(qū)(subgranular zone，SGZ)，在皮層、下丘腦、黑質(zhì)、脊髓等腦區(qū)也存在神經(jīng)再生。在腦損傷后這些神經(jīng)干細(xì)胞增殖被激活，參與損傷組織的修復(fù)。成體神經(jīng)再生對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常功能的維持具有重要意義。研究顯示，神經(jīng)退行性疾病及多種精神類

4、疾病往往伴隨有神經(jīng)再生的抑制。而促進(jìn)神經(jīng)再生亦是一些中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的關(guān)鍵。因此成體神經(jīng)再生的調(diào)節(jié)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了新思路，即通過(guò)作用于影響神經(jīng)再生的多個(gè)環(huán)節(jié)，誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)再生，促進(jìn)損傷后組織結(jié)構(gòu)和功能的重建。目前，神經(jīng)再生的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確，研究、揭示神經(jīng)再生的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)是當(dāng)今生命科學(xué)研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。 因此，本文工作應(yīng)用AQP4基因敲除小鼠，給予公認(rèn)的促神經(jīng)再生藥物氟西汀，在基礎(chǔ)狀態(tài)和慢性中度應(yīng)激(Chron

5、ic mild stress， CMS)致神經(jīng)再生抑制的病理狀態(tài)下觀察AQP4敲除對(duì)神經(jīng)再生能力的影響，研究AQP4與神經(jīng)再生的相關(guān)性，為闡明AQP4在神經(jīng)再生調(diào)節(jié)中的重要作用積累學(xué)術(shù)基礎(chǔ)。 目的：從整體、細(xì)胞和分子水平研究AQP4敲除對(duì)氟西汀促海馬神經(jīng)再生的影響及其機(jī)制。 方法：1)連續(xù)4周給予AQP4<'+/+>和AQP4<'-/->CD1小鼠氟西汀(10mg·kg<'-1>·day<'-1>，i.p.)，應(yīng)用陌生環(huán)

6、境禁食和懸尾實(shí)驗(yàn)研究氟西汀對(duì)小鼠行為學(xué)的影響；應(yīng)用CMS建立AQP4<'+/+>和AQP4<'-/->小鼠應(yīng)激模型后，連續(xù)4周給予氟西汀(10 mg·kg<'-1>·day<'-1>，i.p.)，應(yīng)用糖水偏愛和懸尾實(shí)驗(yàn)研究氟西汀對(duì)動(dòng)物抑郁樣癥狀的改善情況。2)BrdU免疫組化檢測(cè)海馬SGZ神經(jīng)干細(xì)胞增殖、存活。GFAP或NeuN免疫熒光表型分析存活的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞分化情況。3)[<'3>H]-TdR摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)氟西汀對(duì)原代培養(yǎng)的成體A

7、QP4<'+/+>和AQP4<'-/->神經(jīng)干細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響。4)Western blotting檢測(cè)海馬CREB、CaMK IV、ERK磷酸化水平和AQP4表達(dá)變化。 結(jié)果：1)連續(xù)4周給予氟西汀(10 mg·kg<'-1>·day<'-1>)能夠顯著降低AQP4<'+/+>CD1小鼠陌生環(huán)境覓食潛伏期，顯著改善AQP4<'+/+>CMS模型小鼠的抑郁樣癥狀；而給予氟西汀對(duì)基礎(chǔ)和病理狀態(tài)下AQP4<'-/->CD1小鼠的行

8、為學(xué)均無(wú)改善作用。2)AQP4基因敲除不影響基礎(chǔ)狀態(tài)海馬SGZ神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。連續(xù)4周給予氟西汀能夠顯著促進(jìn)AQP4<'+/+>小鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖，逆轉(zhuǎn)CMS對(duì)小鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖的抑制，而對(duì)基礎(chǔ)和病理狀態(tài)下AQP4<'-/->小鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖無(wú)促進(jìn)作用。AQP4敲除對(duì)BrdU標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞存活的比例和向神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的比例無(wú)顯著影響。3)氟西汀0.1 μmol·L-<'1>、1 μmol·L-<'1>能夠顯著促

9、進(jìn)原代培養(yǎng)的成體AQP4<'+/+>神經(jīng)干細(xì)胞增殖，但對(duì)AQP4<'-/->神經(jīng)干細(xì)胞增殖無(wú)促進(jìn)作用。4)連續(xù)4周給予氟西汀(10 mg·kg<'-1>·day<'-1>)能夠顯著升高基礎(chǔ)和病理狀態(tài)下AQP4<'+/+>小鼠海馬內(nèi)CREB蛋白磷酸化的水平，而對(duì)AQP4<'-/->小鼠無(wú)顯著影響。對(duì)影響CREB磷酸化的上游激酶研究發(fā)現(xiàn)，給予氟西汀能夠顯著升高AQP4<'+/+>小鼠海馬內(nèi)CaMKIV磷酸化水平，而對(duì)AQP4<'-/->小鼠

10、無(wú)顯著影響。給予氟西汀能夠同時(shí)提高AQP4<'+/+>和AQP4<'-/->小鼠海馬內(nèi)總ERK水平，而對(duì)ERK磷酸化水平均無(wú)影響?；A(chǔ)狀態(tài)下，給予氟西汀對(duì)AQP4<'+/+>小鼠海馬內(nèi)AQP4蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著變化。CMS能顯著促使AQP4<'+/+>小鼠海馬內(nèi)AQP4蛋白表達(dá)水平的上調(diào)，而給予氟西汀能夠使AQP4蛋白表達(dá)恢復(fù)到正常的水平。 結(jié)論：AQP4參與CD1成年鼠海馬神經(jīng)再生的調(diào)節(jié)，其機(jī)制與調(diào)節(jié)CaMKIV-CREB信號(hào)