七氟烷對成年神經(jīng)再生的作用和機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的: 長期以來，醫(yī)學(xué)界一直認(rèn)為，神經(jīng)細(xì)胞屬于一種永久細(xì)胞，缺乏再生能力，神經(jīng)損傷是不可逆轉(zhuǎn)的。盡管早期有許多學(xué)者指出，哺乳動物可能具備成年神經(jīng)再生的能力，但是由于檢測技術(shù)的落后，這些假說遲遲未能得到證實(shí)。近年研究表明，成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)仍有神經(jīng)再生。成年神經(jīng)再生，包括神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化、成熟及向神經(jīng)回路整合四個步驟。GABA信號通路被認(rèn)為是目前與成年神經(jīng)再生關(guān)系最密切的通路之一，在神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、存活、分化等方面

2、均有重要的作用。七氟烷是一種誘導(dǎo)迅速，無惡味，麻醉深度易掌握的近幾年步入臨床的吸入麻醉藥。因其具有全麻誘導(dǎo)快，蘇醒迅速，對呼吸道無刺激，肌松作用好，對循環(huán)影響小等一系列優(yōu)點(diǎn)，如今臨床應(yīng)用較為廣泛。而目前其在成年神經(jīng)再生中的作用的研究僅僅觀察了活體內(nèi)的作用，并未考慮復(fù)雜的體內(nèi)微環(huán)境可能產(chǎn)生的復(fù)雜影響。 本研究的目的就是通過制備四血管夾閉大鼠全腦缺血模型，在體外觀察七氟烷對成年神經(jīng)再生的作用；然后通過體外培養(yǎng)細(xì)胞模型研究七氟烷對成年

3、神經(jīng)干細(xì)胞的直接作用，選擇了同時參與了GABA和Wnt信號通路的CREB作為候選信號分子，對七氟烷在成年神經(jīng)再生中的作用和可能的機(jī)制進(jìn)行探討。 材料和方法： 1.實(shí)驗(yàn)分組 SPF級SD雄性大鼠50只，體重250±20g，隨機(jī)分為5組，每組10只，第一組：七氟烷（3.5ml/kg）+四血管夾閉大鼠全腦缺血模型組；第二組：七氟烷（3.5ml/kg）+假手術(shù)組；第三組：七氟烷（7ml/kg）+四血管夾閉大鼠全腦缺血模

4、型組；第四組：七氟烷（7ml/kg）+假手術(shù)組；第五組：生理鹽水+四血管夾閉大鼠全腦缺血模型。采用腹腔注射給藥（3.5ml/kg或7ml/kg），各組動物手術(shù)前均連續(xù)給藥7天，于第7天給藥后1h造模。 2.實(shí)驗(yàn)方法 2.1四血管夾閉大鼠全腦缺血模型的制作 制作模型前一天大鼠被禁食過夜，以保證均一的血糖水平。手術(shù)前給予大鼠腹腔注射10%水合氯醛（40mg/100g體重），待大鼠瞬目反射消失，剪掉頸前毛，酒精消毒后切

5、開前頸皮膚，鈍性分離暴露雙側(cè)頸總動脈后用手術(shù)縫線做好標(biāo)記，關(guān)閉切口。將大鼠固定在大鼠腦立體定位儀上，剪掉后頸毛發(fā)，酒精消毒后沿著正中線切開皮膚，鈍性分離暴露雙側(cè)椎動脈，使用25W電烙鐵短暫熱凝永久阻塞椎動脈，用1ml皮試注射器針頭探查阻塞確實(shí)后關(guān)閉切口。當(dāng)夜給予大鼠少量食物和水。第二天，將清醒動物固定后，消毒手術(shù)區(qū)，打開頸前切口，利用標(biāo)記用手術(shù)縫線將動脈夾放置在雙側(cè)頸總動脈上夾閉15分鐘，由于頸動脈和椎動脈此時皆已關(guān)閉，造成大鼠大腦缺血

6、，表現(xiàn)為意識喪失，角膜反射、翻正反射消失，瞳孔散大，無癲癇、抽搐、呼吸暫停、口鼻血性泡沫痰、大小便失禁等過度損傷表現(xiàn)，不符合以上表現(xiàn)的被排除出缺血損傷組，期間適時給予電熱毯保溫保證肛溫與正常大鼠相同。夾閉結(jié)束取出動脈夾，使大鼠腦血流灌注恢復(fù)并形成缺血再灌注損傷，關(guān)閉切口，將手術(shù)后動物放置在溫暖干燥的環(huán)境中，給予自由的飲水飲食。第二天只打開頸前切口，而不夾閉頸總動脈的大鼠歸入假手術(shù)組。 2.2 BrdU標(biāo)記和海馬組織冰凍切片的制備

7、 各組大鼠分別于手術(shù)處理后腹腔注射BrdU（100mg/kg），連續(xù)3天。28天后，各組大鼠分別腹腔注射10%水合氯醛（40mg/100g體重），待大鼠瞬目反射消失，4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注固定，取腦修塊后，再用4%多聚甲醛后固定4-6小時，流水沖洗1-2小時，30%蔗糖PBS溶液中脫水2-3天直至腦塊沉底，隨后取出在冰凍切片機(jī)上選取海馬形態(tài)典型的冠狀切面切成20μm薄片后貼至涂有明膠的載玻片上，在室溫下晾干2小時后微波爐中火5分

8、鐘烤片，以確保腦片貼合牢固，同時可以修復(fù)抗原以備免疫組織化學(xué)檢測用。 2.3免疫組化染色 a.各組切片先用2N HCl在37℃處理30min，0.1M硼酸鹽緩沖液（pH8.5）處理10min； b.0.1M PBS（pH7.4）沖洗3×10min； c.室溫下封閉液孵育2h（0.3% Triton X-100，0.1% BSA和2% normal goat serum溶于PBS）； d.B

9、rdU：BrdU一抗4℃孵育24h； NeuN：NeuN一抗4℃孵育24h； BrdU/NeuN雙標(biāo)：同時用BrdU和NeuN一抗4℃孵育24h e·0.1M PBS（pH7.4）沖洗3×10min； f.BrdU：BrdU二抗室溫下避光孵育2h； NeuN：NeuN二抗室溫下避光孵育2h；BrdU/NeuN雙標(biāo)：同時用BrdU和NeuN二抗室溫下避光孵育2h； g.0.1M PBS（pH7.4）沖洗3×1

10、0min； h.刷片，空氣中干燥24h； i.二甲苯透明后，中性樹脂封片，干燥后備鏡檢各組均設(shè)立不加一抗和不加二抗兩組對照。 2.4陽性細(xì)胞計(jì)數(shù) 應(yīng)用圖像分析軟件AlphaEase FC在光鏡（20×）下計(jì)數(shù)各組切片大鼠海馬齒狀回SGZ（Subgranular Zone）BrdU陽性細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算各組大鼠海馬齒狀回SGZ（Subgranular Zone）BrdU陽性細(xì)胞數(shù)量的算術(shù)平均值。 3

11、、成年神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定 凍存的成年海馬神經(jīng)干細(xì)胞（SCR022）復(fù)蘇后，重懸在新鮮配制的含有20ng/mL FGF-2的培養(yǎng)液中，在鋪有L-鳥氨酸的培養(yǎng)板里培養(yǎng)，每天換液。 免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定方法如下：培養(yǎng)細(xì)胞棄去培養(yǎng)液后用預(yù)冷的4%多聚甲醛PBS固定，含0.3%Triton的5% BSA封閉25℃60分鐘，Nestin抗體孵育過夜，TRITC二抗孵育，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，在熒光顯微鏡下觀察，紅色熒光陽性的細(xì)胞即為Ne

12、stin陽性成年神經(jīng)干細(xì)胞，藍(lán)色為DAPI染色的細(xì)胞核。 4.實(shí)驗(yàn)方法 4.1七氟烷處理神經(jīng)干細(xì)胞 細(xì)胞鋪板，2小時后在顯微鏡下觀察細(xì)胞是否貼壁，貼壁后，將細(xì)胞放入預(yù)先制備的密閉容器中，容器中七氟烷濃度分別為1.3%，1.9%，2.7%和3.3%（容器內(nèi)還含5%CO2，20% O2，并在一個大氣壓下用氮?dú)馄胶猓?，其?.3%為低濃度組，1.9%和2.7%為中濃度組，3.3%為高濃度組，不含七氟烷作為空白對照組，繼

13、續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞2小時。 4.2神經(jīng)干細(xì)胞核染色和細(xì)胞計(jì)數(shù) 細(xì)胞固定后，加入DAPI染色15分鐘。每組重復(fù)計(jì)數(shù)4孔細(xì)胞，每孔細(xì)胞鏡下（400×）隨機(jī)選擇四個視野，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并相加作為該孔的細(xì)胞總數(shù)。每組4孔的細(xì)胞總數(shù)相加后取平均數(shù)代表該組的細(xì)胞總數(shù)，空白組的細(xì)胞經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后記為100。 4.3免疫印跡 CREB和pCREB的表達(dá)水平用免疫印跡方法測定。將細(xì)胞分為三組：空白組（不加任何處理），低濃度七氟烷

14、組（1.3%七氟烷處理）和中濃度七氟烷組（1.9%）。含1mM Na3VO4預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞2次，再用預(yù)冷的緩沖液裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液，SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)印于PVDF膜上，5%脫脂奶封閉后，將PVDF膜與含CREB（1：1000）或pCREB（1：1000）抗體的3%BSA中4℃孵育過夜，再分別加入二抗和化學(xué)發(fā)光試劑，獲得圖像。觀察pCREB和CREB灰度比值來評判CREB的磷酸化水平，空白對照組比值標(biāo)準(zhǔn)化為100，其余

15、組依此標(biāo)準(zhǔn)化。 5.統(tǒng)計(jì)方法 各組數(shù)據(jù)應(yīng)用采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）表示，檢驗(yàn)方差齊性后（P>0.05），采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，P<0.05被認(rèn)為有顯著性差異，各組均數(shù)間的多重比較采用LSD法（Least-significant difference test）。 結(jié)論: 1.腹腔給予四血管夾閉大鼠全腦缺

16、血模型七氟烷3.5ml/kg和7.0ml/kg均可促進(jìn)大鼠海馬齒狀回的新生神經(jīng)元數(shù)目增多，說明七氟烷可以促進(jìn)成年神經(jīng)再生，且這種促進(jìn)作用可能具有濃度依賴性。本研究中七氟烷對假手術(shù)組大鼠的成年神經(jīng)再生無明顯影響，這可能是由于七氟烷產(chǎn)生成年神經(jīng)再生作用需要一定的刺激。 2.在本研究的體外實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)七氟烷在中濃度（1.9%和2.7%）和高濃度（3.3%）可以促進(jìn)ANSCs的增殖，而空白對照組和低劑量（1.3%）無明顯作用。證明了