Hes1在成年神經(jīng)再生修復(fù)海馬損傷中作用的研究.pdf

1、目的：以RNA干擾技術(shù)為載體，探索活體內(nèi)RNAi介導(dǎo)的Hes1基因下調(diào)的可行性及有效性，進(jìn)一步驗(yàn)證Hes1基因?qū)Τ赡陚€(gè)體神經(jīng)生成的作用，并研究轉(zhuǎn)染后Hes1的表達(dá)變化對(duì)腦創(chuàng)傷后的神經(jīng)功能修復(fù)作用。通過(guò)本研究，初步探討Hes1基因調(diào)控成年神經(jīng)細(xì)胞生成的可能機(jī)制，尋找促進(jìn)成年神經(jīng)細(xì)胞生成的方法，為腦創(chuàng)傷的臨床治療提供新思路。
　　 方法：選取130只成年C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3個(gè)組：①立體定向注射溶于5％葡萄糖的載體-PEI和陰

2、性對(duì)照siRNA于鼠腑組(n=50)(NC組)；②假手術(shù)組(n=15)(TBI組)；③立體定向注射溶于5％葡萄糖的PEI和Hes1-siRNA的混合物于鼠腦組(n=65)(轉(zhuǎn)染組)并對(duì)小鼠進(jìn)行中度液壓腦創(chuàng)傷。所有小鼠購(gòu)買(mǎi)后先在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1周，然后放到Morris水迷宮的水缸中做適應(yīng)性游泳一次，第二天開(kāi)始Morris水迷宮訓(xùn)練，每天游泳4次，每次隨機(jī)從不同入水點(diǎn)進(jìn)入水缸游泳，訓(xùn)練持續(xù)5天。水迷宮訓(xùn)練結(jié)束后第2天行siRNA轉(zhuǎn)染，連續(xù)3天，

3、并將NC組和TBI組進(jìn)行如前所述的相對(duì)應(yīng)處理。上述各組在做了相應(yīng)處理24h后，NC組和轉(zhuǎn)染組各取5只小鼠，提取海馬組織總mRNA行Real time RT-PCR實(shí)驗(yàn)，篩選最佳siRNA序列，并應(yīng)用于后續(xù)試驗(yàn)。最佳序列處理小鼠24小時(shí)后取3只轉(zhuǎn)染組小鼠進(jìn)行熒光染色，觀察轉(zhuǎn)染部位，剩余的小鼠進(jìn)行液壓腦創(chuàng)傷打擊，力度為2.1～2.2ATM。在創(chuàng)傷模型制作前30分鐘對(duì)所有小鼠進(jìn)行BrdU腹腔注射，劑量為200mg/kg，傷后進(jìn)行mNSS神經(jīng)功

4、能評(píng)分。在siRNA轉(zhuǎn)染后3天，每組分別隨機(jī)取5只小鼠進(jìn)行冰凍切片，隨機(jī)取腦片進(jìn)行HE、Hes1、BrdU染色，熒光免疫組織化學(xué)的結(jié)果在熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡下觀察并記錄陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)。在siRNA轉(zhuǎn)染后1天，2天，3天，14天四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每組再分別隨機(jī)取6只小鼠，提取海馬組織總蛋白進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)轉(zhuǎn)染組及NC組Hes1基因在海馬組織中的表達(dá)情況。在創(chuàng)傷后第3天剩余小鼠行第二次水迷宮訓(xùn)練，持續(xù)4天，并在二次訓(xùn)練后第

5、7天進(jìn)行檢測(cè)，以觀察小鼠行為學(xué)上的變化。水迷宮訓(xùn)練結(jié)束后，取鼠腦做冰凍切片，進(jìn)行BrdU+NeuN雙重染色，在熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡下觀察并記錄陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)。
　　 結(jié)果：1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)到轉(zhuǎn)染組Hes1 mRNA的表達(dá)量均明顯下降，其中Mus-Hes1-siRNA-7抑制效率達(dá)70％以上，為最佳者。2、在小鼠海馬液壓創(chuàng)傷后24-72小時(shí)，對(duì)照組小鼠mNSS評(píng)分顯著高于轉(zhuǎn)染組(P<0.05)，隨時(shí)間延長(zhǎng)，6天后對(duì)

6、照組與轉(zhuǎn)染組無(wú)差異(P>0.05)。3、腦創(chuàng)傷后Morris水迷宮訓(xùn)練，轉(zhuǎn)染組成績(jī)明顯優(yōu)于兩個(gè)對(duì)照組成績(jī)，差異明顯(P<0.05)；二次訓(xùn)練完畢后第7天行定位導(dǎo)航及空間搜索檢測(cè)，轉(zhuǎn)染組與兩個(gè)對(duì)照組之間仍存在差異(P<0.05)。4、免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染后24h，熒光蛋白成功地表達(dá)于海馬區(qū)；RNAi后3天，轉(zhuǎn)染組Hes1的表達(dá)較NC組明顯地降低，齒狀回SGZ神經(jīng)前體細(xì)胞的數(shù)量(BrdU+)未見(jiàn)明顯變化；第14天，成熟神經(jīng)元(Br

7、dU+7NeuN+)數(shù)量明顯增加。5、蛋白免疫印跡(Western Blot)結(jié)果顯示，與相NC組比較，轉(zhuǎn)染后Hes1蛋白表達(dá)量均有明顯地下降，前3天降低明顯，差異均有顯著性意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：1、活體內(nèi)Hes1 siRNA的轉(zhuǎn)染，有效地敲低了Hes1在小鼠海馬組織中的表達(dá)。2、中度海馬液壓創(chuàng)傷模型對(duì)小鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能并無(wú)明顯影響，海馬區(qū)的損傷主要表現(xiàn)在小鼠空間學(xué)習(xí)與記憶能力的下降。3、小鼠海馬創(chuàng)傷早期可能出現(xiàn)神經(jīng)

8、元的凋亡進(jìn)而造成了相關(guān)神經(jīng)環(huán)路的損傷，使得小鼠遠(yuǎn)期認(rèn)知功能下降；Hes1基因很可能促進(jìn)了神經(jīng)干細(xì)胞的增殖并使新生神經(jīng)細(xì)胞分化為成熟神經(jīng)元，并整合進(jìn)原有的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中，對(duì)認(rèn)知功能進(jìn)行修復(fù)。4、與相應(yīng)的對(duì)照組相比，創(chuàng)傷后早期BrdU陽(yáng)性細(xì)胞未見(jiàn)明顯變化，表明神經(jīng)干細(xì)胞在創(chuàng)傷因素的刺激下并未出現(xiàn)明顯地增殖，說(shuō)明Hes1基因表達(dá)的降低可能抑制了神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，但促進(jìn)了新生神經(jīng)細(xì)胞向神經(jīng)元的分化和成熟。5、蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果表明在腦創(chuàng)傷后，轉(zhuǎn)染組