肝臟線粒體載體蛋白HDMCP解偶聯(lián)功能及其與非酒精性脂肪性肝病關(guān)系的研究.pdf

1、研究背景與目的： 非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholicfattyliverdisease，NAFLD)是指除外酒精和其他明確的肝損因素所致的，以彌漫性肝大泡性脂肪變、伴或不伴炎癥為主要特征的臨床病理綜合征，包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纖維化以及肝硬化。近年來(lái)，不斷有證據(jù)提示線粒體功能失常在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。解偶聯(lián)蛋白(UCPs)屬于線粒體陰離子載體蛋白超家族，定位于線粒體內(nèi)膜并在多種組織中表達(dá)。UC

2、Ps通過(guò)對(duì)氧化磷酸化的解偶聯(lián)(即質(zhì)子滲漏)而對(duì)線粒體的功能和機(jī)體代謝活動(dòng)產(chǎn)生影響。肝臟是人體最大的代謝器官而其在生理狀態(tài)下線粒體的質(zhì)子滲漏占其總耗氧量的20-30％，提示可能存在UCPs在其中起作用。然而迄今為止并未有任何一種UCP在正常肝細(xì)胞中表達(dá)的報(bào)道。肝癌中下調(diào)的線粒體載體蛋白(HDMCP)是新近克隆出來(lái)并被證明在肝細(xì)胞中特異性表達(dá)的線粒體載體蛋白，既往研究在細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)其具有降低線粒體膜電位的作用，因此其可能就是人們長(zhǎng)期尋找的肝

3、臟特異性UCP。本研究的目的首先是在酵母菌表達(dá)體系中進(jìn)一步研究HDMCP的解偶聯(lián)功能；其次研究HDMCP與NAFLD發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。 研究方法： 在C57小鼠肝臟中用Trizol方法提取總mRNA后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再行PCR特異性擴(kuò)增HDMCPcDNA，后連接至PMDT18載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后送測(cè)序。將測(cè)序證實(shí)無(wú)突變的PMDT18—HDMCP質(zhì)粒再PCR擴(kuò)增并與pYES2載體連接，同樣轉(zhuǎn)化大腸桿菌后

4、質(zhì)粒測(cè)序。將測(cè)序正確的pYES2-HDMCP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌，經(jīng)過(guò)1％的半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)后，提取線粒體并立即在30℃下進(jìn)行呼吸功能測(cè)定，主要指標(biāo)包括解偶聯(lián)率、線粒體呼吸控制及GDP抑制率。隨后，本課題通過(guò)高脂飲食和油酸、棕櫚酸混合物培養(yǎng)成功構(gòu)建NAFLD大鼠及脂質(zhì)沉積細(xì)胞模型，并使用westernblot、RNA干擾等方法研究HDMC在脂質(zhì)沉積中的作用。最后，本課題還采用分光光度法和螢火蟲熒光素酶法分別測(cè)定細(xì)胞模型中過(guò)氧化氫和ATP含量，以

5、研究HDMCP調(diào)控脂質(zhì)水平的下游通路。 本課題比較多地采用生物信息學(xué)的方法，如對(duì)HDMCP與UCP1-5的序列比對(duì)采用clustalW程序，進(jìn)化分析主要采用Mega4軟件包中的鄰近法進(jìn)行構(gòu)樹。在統(tǒng)計(jì)學(xué)上，每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行三次，計(jì)量資料采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤來(lái)表示。非配對(duì)的兩組間比較采用student'st檢驗(yàn)(對(duì)于非正態(tài)分布的兩組間數(shù)據(jù)比較采用Mann—Whitney法)，兩變量間相互關(guān)系的分析采用直線相關(guān)分析進(jìn)行。所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均由

6、專人錄入并在SPSS11.0中進(jìn)行分析，p＜0.05為有顯著性差異。 結(jié)果： 通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)HDMCP與UCP1-5有約40％的序列相似度，且表現(xiàn)出線粒體載體蛋白的基本特征。進(jìn)一步通過(guò)進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)HDMCPs顯著的與UCP4，UCP5以及無(wú)脊椎動(dòng)物中的UCPs序列更相近，提示進(jìn)化上其可能更加原始。Westenblot顯示HDMCP在分離的酵母線粒體中表達(dá)。由于缺乏OXO和UCP1的特異性抗體，本課題采用實(shí)時(shí)定量RF—

7、PCR證實(shí)了二者mRNA在各自轉(zhuǎn)染的酵母線粒體上的表達(dá)(OXO：0.73±0.07；UCP10.81±0.12)。在提取線粒體并測(cè)定解偶聯(lián)率時(shí)，本課題發(fā)現(xiàn)HDMCP具有一定GDP非敏感性的解偶聯(lián)功能，與OXO和pyes2陰性對(duì)照及UCP1陽(yáng)性對(duì)照相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。 與對(duì)照相比，肝指數(shù)、血清膽固醇與甘油三酯、肝臟甘油三酯含量以及HOMA—IR指數(shù)在NAFLD均有顯著性增高。此外，westernblot顯示H

8、DMCP在NAFLD模型組中顯著增高。而細(xì)胞脂質(zhì)含量及甘油三酯水平在模型組也比對(duì)照組有2-7倍的增高。隨著高脂培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，HDMCP水平逐漸上升。通過(guò)RNA干擾，L02與HepG2細(xì)胞中HDMCP的表達(dá)分別下調(diào)了60％與62％，伴細(xì)胞脂質(zhì)含量及甘油三酯的顯著增高，而control—shRNA則無(wú)顯著作用。此外，NAFLD動(dòng)物與細(xì)胞模型中的ATP含量以及細(xì)胞模型中的H2O2(ROS的代表物)水平比對(duì)照均呈顯著下降，然而這種作用部分被H

9、DMCP—shRNA通過(guò)下調(diào)HDMCP水平所抑制。同時(shí)ATP水平與其相應(yīng)的HDMCP水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.93，L02細(xì)胞，p＜0.05；r=-0.91HepG2細(xì)胞，p＜0.05)。 結(jié)論： 1)通過(guò)在酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)HDMCP，本課題驗(yàn)證了其具有GDP非敏感性的解偶聯(lián)功能，支持“HDMCP可能就是研究人員長(zhǎng)期尋找的肝臟特異性的解偶聯(lián)蛋白”這一假說(shuō)，為全面理解生理狀態(tài)下肝臟線粒體能量代謝提供理論支持。 2)

10、本課題首次發(fā)現(xiàn)并闡明HDMCP在NAFLD大鼠模型及單純脂變模型中表達(dá)上升，通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)HDMCP具有部分調(diào)節(jié)NAFLD細(xì)胞模型中脂質(zhì)沉積的作用，而且該調(diào)控可能通過(guò)降低ATP與H2O2的產(chǎn)生起作用，可能是機(jī)體面對(duì)脂肪過(guò)剩情況下的適應(yīng)性反應(yīng)。因此，HDMCP可能成為今后NAFLD治療干預(yù)的新靶點(diǎn)。 3)由于H2O2是脂質(zhì)過(guò)氧化的重要產(chǎn)物，因此，本課題的研究也提示HDMCP可能在NAFLD從單純性脂變向NASH的進(jìn)展中起到重要