PI3K在哮喘患者T淋巴細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞周期影響的臨床研究.pdf

1、目的：初步了解磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide3-kinase，PI3K）在急性發(fā)作期哮喘患者外周血T淋巴細(xì)胞中的蛋白表達(dá)情況，并觀察利用PI3K特異性抑制劑LY294002阻斷體外培養(yǎng)對(duì)急性哮喘患者及健康人外周血T淋巴細(xì)胞周期分布的影響，以探討PI3K參與T細(xì)胞過度活化增殖在哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用。 方法：（1）病例采集及提純T淋巴細(xì)胞：收集2008年9月至2009年2月間20例急性發(fā)作期哮喘患者（男性12例，

2、女性8例，平均年齡30±9.6歲）作為實(shí)驗(yàn)組，15例健康人（男性9例，女性6例，平均年齡28±8.9歲）為健康對(duì)照組。每一研究對(duì)象于清晨空腹時(shí)，無菌肝素抗凝抽取靜脈血5ml（哮喘患者于使用激素前），F(xiàn)icoll密度梯度離心法提取獲得PBMC，尼龍毛柱法提純T淋巴細(xì)胞；（2）用Western blotting法檢測(cè)哮喘患者T淋巴細(xì)胞中PI3K Y蛋白的表達(dá)水平：將對(duì)數(shù)生長期的T淋巴細(xì)胞分為哮喘組（A組）、對(duì)照組（B組），再將哮喘組隨機(jī)分為

3、3組，分別進(jìn)行檢測(cè)；（3）用MTT法觀察T淋巴細(xì)胞增殖情況：將對(duì)數(shù)生長期的哮喘患者的T淋巴細(xì)胞及正常人的T淋巴細(xì)胞分為A組（正常人不加LY294002組）、B組（正常人加LY294002組）、C組（哮喘不加LY294002組）、D組（哮喘加LY294002組），在培養(yǎng)24、48、72、96h后測(cè)定細(xì)胞增殖率；（4）用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的時(shí)相分布：將對(duì)數(shù)生長期的哮喘患者的T淋巴細(xì)胞及正常人的T淋巴細(xì)胞分為E組（哮喘加LY294002組

4、）、F組（哮喘不加LY294002組）、G組（正常人不加LY294002組），流式細(xì)胞儀檢測(cè)G0/G1期、S期分布。 結(jié)果：（1）Western blotting方法檢測(cè)哮喘組與對(duì)照組T淋巴細(xì)胞中磷酸化PI3Ky蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與正常人相比，急性哮喘發(fā)作期患者外周血T淋巴細(xì)胞中的PI3Ky蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)。正常對(duì)照組外周血T淋巴細(xì)胞中PI3Ky蛋白表達(dá)較低（10945±960），哮喘組（20079±838.7），表達(dá)差異

5、顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；3個(gè)哮喘組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。（2）MTT結(jié)果顯示：在24h點(diǎn)，A組增殖率（0.309±0.088）、B組增殖率（0.272±0.014）、C組增殖率（0.630±0.051）、D組增殖率（0.470±0.050）；在48h點(diǎn)A組增殖率（0.269±0.005）、B組增殖率（0.230±0.013）、C組增殖率（0.565±0.040）、D組增殖率（0.435±0.052）；在72

6、h點(diǎn)A組增殖率（0.309±0.009）、B組增殖率（0.272±0.014）、C組增殖率（0.627±0.051）、D組增殖率（0.473±0.050）；在96h點(diǎn)A組增殖率（0.274±0.007）、B組增殖率（0.245±0.010）、C組增殖率（0.587±0.046）、D組增殖率（0.410±0.041）；在24、48、72、96h時(shí)間點(diǎn)，A、B、C、D四組間進(jìn)行組間比較，除A組與B組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義以外（P>0.05），其

7、余各組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（3）將E組、F組、G組的T淋巴細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的時(shí)相分布。結(jié)果顯示：E組G0/G1期分布比例為91.85%±7.63%，F(xiàn)組G0/G1期分布比例為77.40%±6.42%，G組G0/G1期分布比例為99.25%±0.01%，各組間的G0/G1期分布比例比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；E組S期分布比例為5.21%±2.33%，F(xiàn)組S期分布比例為19.73%±10.6