ILT2在結(jié)核患者NK細(xì)胞的表達(dá)及作用研究.pdf

1、結(jié)核病是引起死亡人數(shù)高居第二位的感染性疾病。由于耐藥結(jié)核的產(chǎn)生、艾滋病感染流行、人口流動(dòng)和臨床免疫抑制劑的應(yīng)用增多等原因，全球結(jié)核病疫情非常嚴(yán)重，僅2012年，全球新發(fā)結(jié)核病例達(dá)860萬(wàn)，有130萬(wàn)人死于結(jié)核病，約45萬(wàn)人為耐多藥結(jié)核病。我國(guó)現(xiàn)有活動(dòng)性肺結(jié)核病人約500萬(wàn)，每年約有13萬(wàn)人死于結(jié)核病。盡管結(jié)核感染人數(shù)眾多，但是僅有5-10％的感染者發(fā)展成為活動(dòng)性結(jié)核。研究結(jié)果表明，結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸不僅僅取決于結(jié)核分枝桿菌的數(shù)量和

2、毒力，在很大程度上還取決于機(jī)體的免疫狀態(tài)。
　　宿主固有免疫在結(jié)核病早期發(fā)揮抗結(jié)核分枝桿菌感染作用，而且對(duì)于激發(fā)宿主獲得性免疫也發(fā)揮了重要作用。在結(jié)核分枝桿菌入侵早期，獲得性免疫未被充分激活之前，固有免疫系統(tǒng)在結(jié)核分枝桿菌的控制和清除過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。參與固有免疫細(xì)胞主要為NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞等，它們無(wú)須抗原預(yù)先致敏，主要通過(guò)釋放細(xì)胞因子、穿孔素、顆粒酶、表達(dá)配體等發(fā)揮作用，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞聚集，殺傷靶細(xì)胞。

3、
　　NK細(xì)胞是參與抗結(jié)核固有免疫的重要細(xì)胞，具有細(xì)胞毒性效應(yīng)，能分泌IFN-γ等細(xì)胞因子，同時(shí)具有免疫調(diào)節(jié)的功能。為了保持抗感染免疫的平衡，NK細(xì)胞的功能由位于細(xì)胞表面不同的激活和抑制型受體共同進(jìn)行調(diào)節(jié)。免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄子2（ILT2，又稱CD85j，LILRB1，LIR-1）是一種Ⅰ型轉(zhuǎn)膜蛋白，胞漿區(qū)含有四個(gè)免疫受體酪氨酸抑制性基序。該受體通過(guò)動(dòng)員如SHP-1的Src同源結(jié)構(gòu)域(SH2)蛋白參與ITIM酪氨酸磷酸化的負(fù)信號(hào)調(diào)節(jié)

4、。ILT2在NK細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突細(xì)胞上均有表達(dá)，與MHC-I類分子(HLA-A，HLA-B，HLA-C，HLA-E和HLA-G)結(jié)合，同時(shí)，ILT-2還能識(shí)別其他蛋白，如人類巨細(xì)胞病毒(HCMV)編碼的UL18蛋白。目前，ILT2在抗結(jié)核感染免疫中的作用尚不明確。為此，本論文開展了對(duì)ILT2在結(jié)核患者NK細(xì)胞的表達(dá)及作用的研究:
　　第一，研究NK細(xì)胞及亞群在肺結(jié)核患者外周血淋巴細(xì)胞的分布情況，研究ILT2在肺

5、結(jié)核患者NK細(xì)胞上的表達(dá)及與結(jié)核病情嚴(yán)重程度的關(guān)系。研究對(duì)象包含肺結(jié)核組(n=70)和健康對(duì)照組(n=67)，根據(jù)痰涂片或痰培養(yǎng)結(jié)果將肺結(jié)核組分為菌陽(yáng)組(n=41)和菌陰組肺結(jié)核組(n=29)。
　　首先采集活動(dòng)性肺結(jié)核組和健康對(duì)照組的新鮮外周EDTA抗凝血，密度梯度離心分離PBMCs，用熒光標(biāo)記的抗人CD3、CD56、CD16進(jìn)行染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3-CD56+NK細(xì)胞及兩個(gè)亞型CD3-CD56dimCD16+和CD3-C

6、D56bright CD16+/-的分布比例。研究結(jié)果顯示，活動(dòng)性肺結(jié)核患者外周血淋巴細(xì)胞群中CD3-CD56+NK細(xì)胞的比例為2.3％（1.2％-4.0％），明顯低于健康對(duì)照組(7.8％;6.5％-11.9％)，p＜0.0001;活動(dòng)性肺結(jié)核外周血淋巴細(xì)胞群中CD3-CD56dimNK細(xì)胞的比例(3.6％;2.2-6.7％)明顯低于健康對(duì)照組(9.2％;6.2-14.1％; p＜0.0001)，活動(dòng)性肺結(jié)核組外周血淋巴細(xì)胞群中CD3-

7、CD56brightNK細(xì)胞的比例(0.3％;0.2-0.6％)較健康對(duì)照組(0.5％;0.3-0.6％)顯著下降(p=0.0002)。研究結(jié)果表明活動(dòng)性肺結(jié)核患者外周血NK細(xì)胞及亞群的比例均明顯下降。
　　其次，采集肺結(jié)核組和健康對(duì)照組的新鮮外周EDTA抗凝血，密度梯度離心分離PBMCs，用熒光標(biāo)記的抗人CD3、CD56、CD16和ILT2染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ILT2抗體在NK細(xì)胞不同亞群上的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，活動(dòng)性肺結(jié)核患者

8、ILT2+CD56dimCD16+ NK細(xì)胞比例45.7％(33.9％-56.2％)明顯高于健康對(duì)照者19.1％(9.9-30.0％)，(p＜0.0001)。ILT2在活動(dòng)性肺結(jié)核組CD56brightCD16+/-NK細(xì)胞上的表達(dá)比例為2.6％(1.4-4.9％)，與健康對(duì)照組CD56brightCD16+/-NK細(xì)胞表達(dá)的比例2.4％(0.7-5.7％)相似，結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.5163)。研究結(jié)果表明活動(dòng)性肺結(jié)核患者外周血I

9、LT2+CD56dimCD16+ NK細(xì)胞表達(dá)比例明顯高于健康對(duì)照者。
　　此外，比較了ILT2在菌陽(yáng)活動(dòng)性肺結(jié)核組和菌陰活動(dòng)性肺結(jié)核組D56dimCD16+-NK細(xì)胞上的表達(dá)，分析ILT2在肺結(jié)核患者NK細(xì)胞上的表達(dá)與結(jié)核病病情的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ILT2在菌陽(yáng)肺結(jié)核組CD56dimCD16+ NK細(xì)胞上的表達(dá)比例(55.3％;45.4-59.9％)明顯高于菌陰肺結(jié)核組(32.9％;23.3-42.0％)， p＜0.0001。

10、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ILT2在CD56dimCD16+ NK細(xì)胞上的表達(dá)水平與肺結(jié)核病的病情嚴(yán)重程度相關(guān)。
　　第二，通過(guò)研究ILT2表達(dá)與NK細(xì)胞CD107a表達(dá)的關(guān)系及ILT2表達(dá)與NK細(xì)胞分泌IFN-γ的關(guān)系，探究ILT2對(duì)肺結(jié)核患者NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用和干擾素分泌的影響。同時(shí)通過(guò)檢測(cè)ILT2+ CD56dimNK細(xì)胞的自然凋亡與ILT2-CD56dimNK細(xì)胞的自然凋亡以研究ILT2對(duì)NK細(xì)胞的自然凋亡作用。研究對(duì)象為38例活動(dòng)性

11、結(jié)核患者，痰涂片或痰培養(yǎng)結(jié)果陽(yáng)性。
　　首先，以K562細(xì)胞為靶細(xì)胞，以5∶1比例將15例活動(dòng)性結(jié)核患者外周血單個(gè)核細(xì)胞與靶細(xì)胞K562共孵育，加入抗人CD107a熒光抗體。采用流式細(xì)胞術(shù)分析CD107a在ILT2+ CD56dimNK和ILT2-CD56dim NK細(xì)胞上的表達(dá)區(qū)別。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CD107a在ILT2+CD56dimCD16+ NK細(xì)胞的表達(dá)比例顯著低于ILT2-CD56dimmNK細(xì)胞(p=0.0169)。結(jié)

12、果表明ILT2在CD56dimNK細(xì)胞的表達(dá)與NK細(xì)胞細(xì)胞毒作用缺陷相關(guān)。
　　其次，采用胞內(nèi)染色方法，將10例活動(dòng)性肺結(jié)核患者單個(gè)核細(xì)胞與靶細(xì)胞K562混合孵育，加入monensin，細(xì)胞表面熒光染色后，行細(xì)胞破膜，加入FITC-標(biāo)記抗人IFN-γ單抗，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IFN-γ在ILT2+CD56dimNK細(xì)胞和ILT2-CD56dim NK細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IFN-γ在ILT2+CD56dimNK細(xì)胞的表達(dá)明顯少于I

13、LT2-CD56dimNK細(xì)胞(p=0.0038)。結(jié)果表明ILT2在CD56dim NK細(xì)胞的表達(dá)與NK細(xì)胞IFN-γ分泌水平降低相關(guān)。
　　此外，加入抗ILT2的阻斷抗體及同型對(duì)照抗體，將CD56dimCD16+ NK細(xì)胞與靶細(xì)胞K562進(jìn)行孵育，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)阻斷ILT2信號(hào)通路后CD107a在CD56dimCD16+ NK細(xì)胞上表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，阻斷ILT2信號(hào)通路后，CD107a在CD56dimCD16+ NK細(xì)胞

14、上表達(dá)的比例較加入同型對(duì)照后明顯升高(p=0.0223)。結(jié)果表明阻斷ILT2信號(hào)通路可提高CD56dimCD16+NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。
　　最后，采用AnnexinⅤ與PI雙染方法判定NK細(xì)胞自然凋亡，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，比較分析ILT2+CD56 dim NK細(xì)胞和ILT2-CD56 dimNK細(xì)胞的凋亡比率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ILT2+CD56dim NK細(xì)胞的自然凋亡率顯著高于ILT2-CD56dimNK細(xì)胞(p=0.033

15、5)。研究結(jié)果表明ILT2可促進(jìn)活動(dòng)性肺結(jié)核患者CD56dimCD16+ NK細(xì)胞的自然凋亡。
　　本研究采用流式細(xì)胞術(shù)，開展了對(duì)ILT2在結(jié)核患者NK細(xì)胞的表達(dá)及作用的研究。研究發(fā)現(xiàn)，活動(dòng)性肺結(jié)核患者外周血中NK細(xì)胞及亞群的分布比例均顯著下降;ILT2在活動(dòng)性肺結(jié)核患者CD56dimCD16+NK細(xì)胞上的表達(dá)頻率升高，并與活動(dòng)性結(jié)核病的病情嚴(yán)重程度相關(guān);ILT2對(duì)活動(dòng)性結(jié)核患者CD56dimNK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用和細(xì)胞因子分泌的功