腺苷A2a受體在甲狀腺細(xì)胞的表達(dá)及其在Graves病患者血清IgG誘導(dǎo)VEGF表達(dá)中作用的研究.pdf

1、研究背景:
　　Graves病(Graves Disease，GD)是一種常見的危害人類健康的自身免疫性內(nèi)分泌疾病。GD患者的特征性表現(xiàn)為甲狀腺腫伴明顯的毒性癥狀，腫大的甲狀腺產(chǎn)生過量的甲狀腺激素，作用于全身組織和器官，引起甲狀腺毒癥，同時(shí)甲狀腺內(nèi)血流速度的加快并有豐富的血管形成。大部分患者甲狀腺腫越明顯，甲狀腺內(nèi)血管越豐富，病情越難控制，藥物治療療程越長(zhǎng)，探討甲狀腺腫及血管化形成的機(jī)制對(duì)GD的治療十分重要。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，GD患者

2、的血清中針對(duì)甲狀腺細(xì)胞TSH受體的特異性自身抗體，即TSH受體抗體(TSH receptor antibodies，TRAb)，與TSH受體結(jié)合后激活腺苷酸環(huán)化酶信號(hào)系統(tǒng)，導(dǎo)致甲狀腺細(xì)胞增生和甲狀腺激素合成、分泌增加。因此早期研究中，TRAb被認(rèn)為是GD的主要致病因素，也是引起甲狀腺細(xì)胞增生從而引起甲狀腺腫的主要致病因子。除長(zhǎng)期持續(xù)的TRAb激活引起的甲狀腺細(xì)胞的增生外，生長(zhǎng)因子表達(dá)的增加也被認(rèn)為是甲狀腺腫發(fā)生的重要原因，其中以血管內(nèi)皮

3、生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growthfactor,VEGF)的作用較為突出。生長(zhǎng)因子以內(nèi)分泌、旁分泌和自分泌等方式，廣泛而精細(xì)的地調(diào)節(jié)甲狀腺細(xì)胞及其周邊細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和功能，參與甲狀腺疾病的發(fā)生發(fā)展過程。但甲狀腺自身抗體如何影響生長(zhǎng)因子表達(dá)進(jìn)而在甲狀腺腫形成中發(fā)揮作用的機(jī)制仍不清楚。
　　腺苷是ATP及cAMP的代謝產(chǎn)物，其本身也能夠與細(xì)胞膜上的腺苷受體結(jié)合，通過細(xì)胞內(nèi)的第二信使進(jìn)一步發(fā)揮作用。199

4、2年Ledent等通過將腺苷A2a受體（Adenosine A2a Receptor，A2 aR）與甲狀腺球蛋白(Thyroglobulin，TG)啟動(dòng)子相連接而建立了甲狀腺腫大合并功能亢進(jìn)的小鼠模型，病理切片顯示該小鼠的甲狀腺增生明顯并有大量的血管形成。因此我們假設(shè)，A2aR可能在GD甲狀腺腫發(fā)生的過程中起到一定作用。此前腺苷A2a受體作為VEGF轉(zhuǎn)錄表達(dá)的上游調(diào)節(jié)受體已在其他組織細(xì)胞被廣泛研究，目前甲狀腺上尚未有A2aR與VEGF關(guān)

5、系的相關(guān)報(bào)道。
　　腺苷A2a受體的激活促進(jìn)血管形成機(jī)制的研究大部分集中在腫瘤組織血管新生及缺氧環(huán)境誘發(fā)血管生成上。缺氧和應(yīng)激引起腺苷生成增加，A2aR被激活后促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)低氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia-inducible factors-1 alpha，HIF-1 alpha)進(jìn)入細(xì)胞核，與VEGF啟動(dòng)子上HIF-1 alpha結(jié)合位點(diǎn)HIF反應(yīng)原件(HIF-responsiveelements，HRE)相結(jié)合，直接促進(jìn)VEGF的轉(zhuǎn)

6、錄。近期報(bào)道顯示，過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活子1 alpha(Peroxisome Proliferator-ActivatedReceptor Gamma Co-activator Protein1 alpha，PGC-1 alpha)及Ser133磷酸化的cAMP反應(yīng)原件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein，p-CREB)均能夠在不依賴于HIF-1 alpha的情況下獨(dú)立促進(jìn)V

7、EGF的轉(zhuǎn)錄。既往研究表明，p-CREB、PGC-1 alpha、HIF-1 alpha的表達(dá)均與細(xì)胞內(nèi)cAMP的升高有關(guān)，而A2aR作為Gs蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptors，GPCR)，其激活可引起細(xì)胞內(nèi)cAMP的水平明顯增高。因此我們認(rèn)為，A2aR可能通過cAMP/p-CREB/PGC-1 alpha/HIF-1 alpha引起VEGF表達(dá)增加。
　　本項(xiàng)目證實(shí)腺苷A2a受體存在于甲狀腺細(xì)胞

8、膜，且有功能活性;A2aR參與Graves病患者自身抗體調(diào)節(jié)甲狀腺細(xì)胞VEGF表達(dá)，其可能機(jī)制是:GD IgG作用于甲狀腺細(xì)胞，引起cAMP的產(chǎn)生增加，一方面直接通過cAMP/p-CREB/PGC-1alpha/HIF-1 alpha引起VEGF表達(dá)增加;另一方面，cAMP降解使得細(xì)胞外腺苷水平升高，從而激活A(yù)2aR，進(jìn)一步引起細(xì)胞內(nèi)cAMP的增多。
　　目的:
　　1、確定A2aR在大鼠甲狀腺細(xì)胞（Fisher rat t

9、hyroid cell line-5，F(xiàn)RTL-5）、人甲狀腺原代細(xì)胞、大鼠甲狀腺、小鼠甲狀腺及人甲狀腺中的mRNA和蛋白表達(dá)。
　　2、通過A2aR激動(dòng)劑或粗提甲亢患者血清IgG(GD IgG)刺激甲狀腺細(xì)胞，觀察VEGF mRNA和蛋白表達(dá)的變化，初步探討GD IgG及A2aR與VEGF表達(dá)的關(guān)系。
　　3、通過A2aR激動(dòng)劑或粗提甲亢患者血清IgG刺激甲狀腺細(xì)胞，檢測(cè)CREB、 p-CREB、PGC-1 alpha、H

10、IF-1 alpha的蛋白水平，探討GD IgG及A2aR引起VEGF分泌增加的可能機(jī)制。
　　4、通過注射特異性表達(dá)人TSH受體的腺病毒建立GD小鼠模型，檢測(cè)p-CREB、PGC-1 alpha、HIF-1 alpha、VEGF的蛋白水平，進(jìn)一步探討GD IgG引起VEGF分泌增加的可能機(jī)制。
　　5、利用A2aR特異性阻斷劑及A2aR特異性小干擾RNA(Small InterferingRNA，siRNA)處理細(xì)胞，檢測(cè)

11、VEGF、p-CREB、PGC-1 alpha、HIF-1 alpha的表達(dá)，探討A2aR在GD IgG所引起的VEGF表達(dá)增加中所起的作用。
　　6、分別使用GD IgG、A2aR特異性激動(dòng)劑、A2aR特異性阻滯劑處理后獲得的甲狀腺細(xì)胞上清，刺激人臍靜脈內(nèi)皮原代細(xì)胞(Primary Human Umbilical VeinEndothelial Cells，HUVEC)，檢測(cè)其增殖情況，探討GD IgG及A2aR處理后甲狀腺細(xì)胞

12、對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。
　　研究方法:
　　1、細(xì)胞培養(yǎng):1）FRTL-5細(xì)胞根據(jù)相應(yīng)參考文獻(xiàn)及ATCC細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)使用Coon's改良的Ham'sF12培養(yǎng)液中加入6種激素進(jìn)行培養(yǎng)。2）人甲狀腺原代細(xì)胞人甲狀腺組織剪碎，Ⅰ型膠原酶與胰酶混合液中37℃消化40-60 min，過濾后洗滌沉淀并種板，使用含新生牛血清及TSH的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。3）人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞以0.125％胰蛋白酶+0.01％ EDTA注入臍靜脈，

13、細(xì)胞分散后洗滌并種板，以含有胎牛血清及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的M199培養(yǎng)基培養(yǎng)。4）大鼠神經(jīng)元原代細(xì)胞新生大鼠腦組織剪碎，0.25％胰蛋白酶消化后過濾洗滌并種板，以含有胎牛血清、葡萄糖、胰島素和P-氨基苯酸的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。
　　2、動(dòng)物模型:通過肌肉注射表達(dá)人TSH受體的腺病毒建立GD小鼠模型。
　　3、臨床病例收集和粗制IgG的提取:收集初發(fā)GD患者，取空腹靜脈血，采用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清TRAb濃度，采用甲狀腺B超測(cè)

14、量甲狀腺體積，并用PEG沉淀法提取血清IgG。
　　4、采用RT-PCR檢測(cè)A2aR mRNA的表達(dá)和VEGF各剪接體mRNA水平變化。
　　5、采用Western Blotting檢測(cè)A2aR、p-CREB、CREB、PGC-1 alpha、HIF-1alpha、VEGF及beta-actin蛋白水平變化。
　　6、采用免疫熒光及免疫組化方法檢測(cè)A2aR、p-CREB、PGC-1 alpha、HIF-1 alpha、

15、VEGF在甲狀腺組織及細(xì)胞中的表達(dá)，H&E染色了解組織結(jié)構(gòu)。
　　7、A2aR基因沉默:采用電轉(zhuǎn)法以A2aR特異性siRNA轉(zhuǎn)染FRTL-5細(xì)胞以沉默A2aR表達(dá)。
　　8、采用酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)甲狀腺細(xì)胞內(nèi)外VEGF蛋白水平。
　　9、采用直接免疫分析方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)外cAMP的含量。
　　10、采用MTT及EdU方法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞增殖情況。
　　結(jié)果:
　　1、A2aR甲狀腺細(xì)胞中的表達(dá):在FRTL-5

16、細(xì)胞、人甲狀腺原代細(xì)胞、大鼠甲狀腺中均擴(kuò)增出與陽(yáng)性對(duì)照相同的mRNA片段;Western Blotting證實(shí)FRTL-5細(xì)胞及人甲狀腺原代細(xì)胞均有與陽(yáng)性對(duì)照相同的蛋白表達(dá);免疫熒光及免疫組化染色證實(shí)A2aR蛋白在FRTL-5細(xì)胞、人甲狀腺原代細(xì)胞、大鼠甲狀腺、小鼠甲狀腺、人甲狀腺細(xì)胞細(xì)胞膜上均有表達(dá)。A2aR的特異性激動(dòng)劑可引起FRTL-5細(xì)胞內(nèi)cAMP劑量依賴性的升高(P＜0.05)。
　　2、正常培養(yǎng)FRTL-5細(xì)胞中可以擴(kuò)

17、增出4個(gè)VEGF亞型:VEGF188，VEGF164，VEGF144和VEGF120，其中，VEGF120和VEGF164是主要成分;人甲狀腺原代細(xì)胞中則可以擴(kuò)增出以下4個(gè)VEGF亞型:VEGF189，VEGF165，VEGF145和VEGF121，其中，VEGF121和VEGF165是主要成分。與對(duì)照組相比，A2aR特異性激動(dòng)劑CGS21680和粗提GD患者血清IgG均可劑量依賴性增加FRTL-5細(xì)胞和人甲狀腺原代細(xì)胞VEGF mRN

18、A各剪接體的表達(dá)(P＜0.05)。FRTL-5細(xì)胞內(nèi)外的VEGF蛋白也隨著CGS21680的作用劑量依賴性地增加(P＜0.05)。
　　3、磷酸化CREB、PGC-1 alpha及HIF-1 alpha均是能夠與VEGF啟動(dòng)子結(jié)合并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子。GD IgG及CGS21680均能增加FRTL-5細(xì)胞中p-CREB、PGC-1 alpha及HIF-1 alpha的表達(dá)。與對(duì)照組相比，腺苷酸環(huán)化酶(Adenylylcyclas

19、e，AC)的特異性激活劑Forskolin可增加FRTL-5細(xì)胞中PGC-1 alpha、HIF-1alpha及VEGF的表達(dá)。而PKA的特異性抑制劑H89可阻斷GD IgG及CGS21680對(duì)PGC-1 alpha和p-CREB表達(dá)的促進(jìn)作用。
　　4、免疫組化證實(shí)，在通過注射表達(dá)TSH受體腺病毒建立的GD小鼠模型中，甲狀腺VEGF、p-CREB、PGC-1 alpha表達(dá)均較對(duì)照組增加，HIF-1 alpha變化不明顯。

20、>　　5、A2aR特異性阻滯劑可阻斷GD IgG對(duì)VEGF mRNA及p-CREB和PGC-1alpha表達(dá)的促進(jìn)作用。在FRTL-5細(xì)胞中沉默A2aR后，GD IgG對(duì)VEGF、p-CREB、PGC-1 alpha和HIF-1 alpha表達(dá)的促進(jìn)作用均減弱。
　　6、取處理后的FRTL-5細(xì)胞上清培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，GD IgG及CGS21680處理后的細(xì)胞上清可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖;提前加入ZM241385預(yù)處理的FRTL-5細(xì)胞上

21、清促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的能力較僅有GD IgG處理的細(xì)胞上清減弱。
　　結(jié)論:
　　1、A2aR在FRTL-5細(xì)胞、人甲狀腺原代細(xì)胞、大鼠甲狀腺、小鼠甲狀腺及人甲狀腺中均有表達(dá)，且該受體蛋白表達(dá)于細(xì)胞膜。激活A(yù)2aR增加細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量。
　　2、GD IgG刺激甲狀腺細(xì)胞可經(jīng)A2aR激活cAMP/p-CREB/PGC-1 alpha/HIF-1alpha通路，增加VEGF表達(dá)。
　　3、GD IgG通過增加甲狀