HIF-2α在冠心病患者單核細(xì)胞中的表達(dá)及其對泡沫細(xì)胞形成影響的研究.pdf

1、背景：
　　冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（coronary atherosclerosis heart disease，CHD），簡稱冠心病，是嚴(yán)重威脅全世界人類健康最重要的心血管疾病之一。它主要的病例生理是冠狀動脈壁內(nèi)過多的脂質(zhì)沉積，促使粥樣硬化斑塊的形成，導(dǎo)致血管腔狹窄或阻塞，或因冠狀動脈痙攣導(dǎo)致心肌細(xì)胞缺血缺氧或壞死而引起的相關(guān)心臟病變，亦稱缺血性心臟?。╥schemic heart disease，IHD）。
　　缺氧作

2、為一種常見的生理和病理現(xiàn)象，近年來，也被發(fā)現(xiàn)同樣存在動脈粥樣硬化中，其在動脈粥樣硬化的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。血管的狹窄或痙攣，導(dǎo)致供血供氧的減少，而斑塊中局部炎癥導(dǎo)致耗氧增加，這樣導(dǎo)致了氧的供需失衡，進(jìn)一步加劇斑塊中缺氧的發(fā)生。缺氧可導(dǎo)致缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α）的高表達(dá)。缺氧可以促進(jìn)斑塊中泡沫細(xì)胞的形成，促進(jìn)炎癥進(jìn)展，加快 ATP消耗，促進(jìn)斑塊中微血管形成，進(jìn)而促使斑塊進(jìn)展。早期，我們課題組也對

3、HIF-1α和冠狀動脈粥樣硬化之間的聯(lián)系進(jìn)行了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)其在外周血炎癥細(xì)胞的表達(dá)水平與冠心病的嚴(yán)重程度相關(guān)。體外細(xì)胞、動物模型中也證實(shí)其對動脈粥樣硬化形成的促進(jìn)作用。而對于與HIF-1α結(jié)構(gòu)類似的HIF-2α卻未被深入探討及研究。
　　過多的脂質(zhì)沉積于冠狀動脈壁，泡沫細(xì)胞聚集并形成斑塊是導(dǎo)致冠狀動脈粥樣硬化的主要環(huán)節(jié)之一,泡沫細(xì)胞主要來源于由內(nèi)皮細(xì)胞間的間隙移入內(nèi)膜下的單核細(xì)胞，其可分化成巨噬細(xì)胞并吞噬過剩的脂質(zhì)后變成泡沫細(xì)胞

4、。脂肪分化相關(guān)蛋白(adipose differentiation-related protein, ADRP)，亦稱plin2，是脂滴形成的相關(guān)蛋白，存在于脂滴表面，近來研究表明它可反映細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚、與脂肪積聚相關(guān)疾病的靈敏而特異的指標(biāo)，并且顯示與脂質(zhì)代謝紊亂為特征的代謝綜合癥及動脈粥樣硬化有著密切聯(lián)系。
　　缺氧在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重大作用，其主要可以促使泡沫細(xì)胞的形成及進(jìn)行一系列的炎癥反應(yīng)。已有研究報(bào)道在體外細(xì)

5、胞及動物模型上，缺氧可促使 ADRP的高表達(dá)，從而促進(jìn)脂質(zhì)堆積及泡沫細(xì)胞的形成，進(jìn)而促進(jìn)AS的進(jìn)展。然而缺氧條件下，可同時誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子1α、2α、3α的高表達(dá)，且有部分文獻(xiàn)證實(shí)在腫瘤細(xì)胞中HIF-2α對ADRP具有調(diào)控作用，HIF-2α通過誘導(dǎo)plin2高表達(dá)，使ER stress減少，從而促使腫瘤細(xì)胞抗凋亡作用，但HIF-2α和ADRP二者的關(guān)系在人單核巨噬細(xì)胞上是否也存在還是未知的。迄今為止，在冠心病患者中HIF-2α和ADRP

6、兩者的表達(dá)情況，及兩者的相關(guān)性，均未有報(bào)道；且HIF-2α在單核細(xì)胞中是否對ADRP有調(diào)控作用，并對泡沫細(xì)胞的形成產(chǎn)生一定的影響，也是未知的。基于此，在本文中我們將對其進(jìn)行初步探討及研究，這將有可能為未來動脈粥樣硬化的治療提供一個新的靶點(diǎn)。
　　目的：
　　1. HIF-2α在冠心病患者外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)及其與血管病變嚴(yán)重程度的相關(guān)性；
　　2. ADRP在冠心病患者外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)情況；
　　3.體外

7、培養(yǎng)并誘導(dǎo)人THP-1單核巨噬細(xì)胞后，分析ox-LDL對HIF-2α和ADRP的誘導(dǎo)和表達(dá)情況；
　　4.體外培養(yǎng)并誘導(dǎo)人THP-1源性巨噬細(xì)胞，利用siRNA技術(shù)沉默HIF-2α后，分析HIF-2α/ADRP通路在泡沫細(xì)胞形成過程中的作用。
　　方法：
　　1.選擇2013年5月至2015年1月期間在汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科住院，并行冠脈造影術(shù)檢查的248例患者為研究對象，排除既往有心功能不全病史、肺梗塞

8、、心包炎、心肌炎、心肌病、腦血管病、主動脈夾層、周圍血管病、免疫及結(jié)締組織疾病、急慢性炎癥、貧血、甲亢、發(fā)熱等。依據(jù)冠脈造影結(jié)果，將其分為非冠心病組89例，冠心病患者組159例(其中1支血管病變組69例、2支血管病變組46例、3支血管病變組44例)。同時采用Gensini評分系統(tǒng)對冠心病病變嚴(yán)重程度進(jìn)行評判。
　　2.抽取個體造影前外周血10ml，提取單核細(xì)胞，實(shí)時熒光定量 RT-PCR測定HIF-2α、ADRP mRNA相對表達(dá)

9、量。
　　3.培養(yǎng)人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞；加入佛波醇PMA(100 mg/L),誘導(dǎo)其為貼壁的巨噬細(xì)胞。再用終濃度為50.0mg/L的ox-LDL作用24h，使之成為泡沫細(xì)胞；實(shí)時熒光定量RT-PCR及Western blotting檢測HIF-2α及ADRP mRNA及蛋白水平的表達(dá)。
　　4.利用RNA干擾技術(shù)（RNA interference，RNAi），用lipo2000作為介質(zhì)轉(zhuǎn)染單核巨噬細(xì)胞后，用實(shí)時熒光定量

10、RT-PCR分別檢測HIF-2α及ADRP mRNA表達(dá)，用Western blotting檢測HIF-2α及ADRP蛋白表達(dá)水平。
　　5.培養(yǎng)誘導(dǎo)人單核巨噬細(xì)胞，利用lipo2000轉(zhuǎn)染24h后，加入50.0mg/L ox-LDL作用24h，油紅O(Oil red)及膽固醇檢測試劑盒對細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)進(jìn)行檢測，觀察HIF-2α/ADRP通路對泡沫細(xì)胞形成的影響。
　　6.數(shù)據(jù)均釆用?X土 SEM表示，兩組間比較用獨(dú)立樣本 t檢

11、驗(yàn)，多組比較用 One-Way ANOVA(方差齊時多組間多重比較使用 LSD法；方差不齊時，則用Welch法，多重比較用 Tamhane's T2法)，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，兩個變量間相關(guān)關(guān)系判斷用spearman相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.與對照組相比，HIF-2α mRNA的相對表達(dá)量在冠心病患者中高表達(dá)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01；且與血管病變嚴(yán)重程度正相關(guān)；
　　

12、2.與對照組相比，ADRP mRNA的相對表達(dá)量在冠心病者中高表達(dá)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01；與血管病變程度相關(guān)；且與HIF-2α的相對表達(dá)量正相關(guān)；
　　3. ox-LDL處理組細(xì)胞與未處理組相比，HIF-2α、ADRP的mRNA和蛋白水平均高表達(dá)(P<0.01)，且隨著作用時間的延長而呈遞增趨勢；
　　4. HIF-2αsiRNA能有效抑制HIF-2α及下調(diào)ADRP的表達(dá)(P<0.01)；
　　5.油紅O結(jié)

13、果顯示，siRNA干擾組與陰性對照組相比，細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯減少；膽固醇檢測結(jié)果示，HIF-2αsiRNA組較陰性對照組相比，細(xì)胞內(nèi)膽固醇濃度明顯下降，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（TC:0.057±0.007 vs.0.031±0.03mmol/mg，p<0.05），表明HIF-2αsiRNA能有效抑制單核巨噬源性泡沫細(xì)胞的形成。
　　結(jié)論：
　　1. HIF-2α mRNA在冠心病患者中呈高表達(dá)趨勢，且與血管病變程度正相關(guān)；可作為冠心病的