mHCN4基因轉(zhuǎn)染犬MSCs心臟原位移植的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的：病竇綜合征和完全性房室傳導(dǎo)阻滯等心律失常威脅生命，常需要植入人工電子起搏器治療。盡管起搏器治療有效，但人工心臟起搏器并非最佳選擇，仍存在一些問題：缺乏對自身組織的生物反應(yīng)性、電池壽命有限、永久性電極的植入、電極位置不穩(wěn)及電磁干擾等，使其應(yīng)用受限。因此，探討對病竇綜合征和完全性房室等緩慢心律失常患者重建具有正常生理功能的“生物心臟起搏器”，以取代電子心臟起搏器治療，是當(dāng)前心臟電生理領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。近年來，雖有將骨髓來源間充質(zhì)干

2、細(xì)胞直接或基因修飾后移植至生物體內(nèi)以構(gòu)建心臟起搏點(diǎn)的研究報(bào)導(dǎo)，但其結(jié)果尚不能令人滿意。
　　 研究表明，起搏離子流(funny current，If)是竇房結(jié)細(xì)胞舒張期自動除極化的主要決定因素，并在心率控制及神經(jīng)遞質(zhì)對心率調(diào)節(jié)中起重要作用，而If形成的分子基礎(chǔ)是超極化激活的環(huán)化核苷酸門控通道(Hyperpolarization-activated，cyclic nucleotide-gatedcation，HCN)基因家族。HC

3、N基因家族包括四個(gè)成員，即HCN1～HCN4，其中HCN4在各種動物竇房結(jié)細(xì)胞中的比例均最高，是If產(chǎn)生及基本心率維持的重要因素。因此為探討mHCN4基因修飾的犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(canine marrow-mesenchymal stemlcells，cMSCs)作為構(gòu)建心臟生物起搏點(diǎn)的可行性，本研究在國家自然科學(xué)基金(30871060)的資助下，利用本課題組構(gòu)建的mHCN4基因慢病毒載體，對基因轉(zhuǎn)染后cMSCs進(jìn)行心室肌外膜下移植，

4、以期獲得具有生物起搏的心臟起搏樣細(xì)胞，為構(gòu)建心臟生物起搏點(diǎn)提供“種子細(xì)胞”。
　　 研究方法：
　　 1.采用細(xì)胞培養(yǎng)初期頻繁換液和減少胰酶消化時(shí)間的方法分離培養(yǎng)cMSCs，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。
　　 2.MTT法檢測細(xì)胞增殖活性及體外培養(yǎng)誘導(dǎo)分化檢測。
　　 3.用流式細(xì)胞儀和細(xì)胞免疫熒光檢測細(xì)胞表面抗原表達(dá)。
　　 4.對轉(zhuǎn)染GFP基因的cMSCs觀察形態(tài)學(xué)及轉(zhuǎn)基因持續(xù)表達(dá)。

5、　　 5.mHCN4慢病毒載體(pLenti6.3-HCN4-IRES2-EGFP)及對照載體(pLenti6.3-IRES2-EGFP)分別轉(zhuǎn)染cMSCs，依據(jù)綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)行流式細(xì)胞篩選，細(xì)胞免疫熒光和werstern blotting檢測mHCN4蛋白表達(dá)。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。
　　 6.全細(xì)胞膜片鉗檢測mHCN4基因轉(zhuǎn)染cMSCs及對照組的離子流通道動力學(xué)特征。
　　 7.基因轉(zhuǎn)染cMSC

6、犬心外膜下移植，恢復(fù)2周，定期檢測體表心電圖。2周后在頸部迷走神經(jīng)刺激誘導(dǎo)緩慢心律失常狀況下，多導(dǎo)電生理儀記錄體表心電圖。心外膜下心室注射部位起搏并記錄體表心電圖。
　　 8.基因轉(zhuǎn)染cMSC犬心臟心外膜下移植后2周，HE染色觀察移植細(xì)胞在心肌組織間存活，組織免疫熒光技術(shù)檢測移植細(xì)胞中GFP和mHCN4蛋白表達(dá)，免疫組織化學(xué)法檢測CD3和IgG及caspase3抗原表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.采用細(xì)胞培養(yǎng)初期

7、頻繁換液和減少胰酶消化時(shí)間的分離培養(yǎng)法，在第3代就可得到純化的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，該細(xì)胞具有良好的增殖活性及誘導(dǎo)分化潛能。
　　 2.該細(xì)胞表面高表達(dá)CD29和CD44抗原，不表達(dá)CD34和CD45抗原。且細(xì)胞易于慢病毒基因轉(zhuǎn)染，且有轉(zhuǎn)基因持續(xù)表達(dá)能力。
　　 3.mHCN4慢病毒載體可成功轉(zhuǎn)染cMSCs，經(jīng)流式細(xì)胞儀篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)mHCN4蛋白的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　 4.對穩(wěn)定表達(dá)mHCN4基因的cMSC

8、s行全細(xì)胞膜片鉗檢測，記錄到超極化激活的內(nèi)向電流，其半數(shù)最大激活電壓為-91.5±9.2mV，斜率為19.4±3.8mV。反轉(zhuǎn)電位是-29.7±2.5mv。該電流對細(xì)胞外Cs+高度敏感，且具有明顯的時(shí)間及電壓依賴特性，在-140 mV電壓下的電流密度為26.4±1.8 pA/pF。在相同記錄條件下，僅轉(zhuǎn)染EGFP的cMSCs及未轉(zhuǎn)染的cMSCs均未記錄到超極化內(nèi)向電流。
　　 5.基因轉(zhuǎn)染MSCs犬心外膜下移植后，心電圖記錄顯示

9、實(shí)驗(yàn)組及對照組心率未見明顯差異，均未記錄到室性心律失常。2周后，在雙側(cè)迷走神經(jīng)刺激下，對照組均出現(xiàn)自發(fā)的房室結(jié)結(jié)性心律，平均心率為21±5次/分，實(shí)驗(yàn)組6只出現(xiàn)室性心律，平均心率為45±9次/分，與對照組心率相比，心率顯著增快，且其心電圖QRS波形與心室起搏心電圖基本一致。停止迷走神經(jīng)刺激后，兩組動物均恢復(fù)竇性心律。
　　 6.mHCN4基因轉(zhuǎn)染MSCs后犬心外膜下移植，MSCs不僅在心肌內(nèi)存活，而且還表達(dá)mHCN4和GFP蛋白

10、，轉(zhuǎn)GFP組MSCs也在體內(nèi)存活，但不表達(dá)mHCN4蛋白。移植部位未見表達(dá)CD3和caspase3及IgG抗原表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1.采用細(xì)胞培養(yǎng)初期頻繁換液和減少胰酶消化時(shí)間的分離培養(yǎng)法，早期就可獲得純化的MSCs，具有良好增殖活性及轉(zhuǎn)基因表達(dá)能力。
　　 2.慢病毒載體基因轉(zhuǎn)染cMSCs后，經(jīng)流式細(xì)胞儀篩選，MSCs持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)mHCN4蛋白及功能性mHCN4通道，產(chǎn)生起搏離子流If，有心臟起搏細(xì)胞的

11、電生理學(xué)特性。僅轉(zhuǎn)GFP基因及未轉(zhuǎn)染的cMSCs不表達(dá)mHCN4蛋白和起搏離子流If。
　　 3.mHCN4基因轉(zhuǎn)染MSCs后犬心外膜下移植2周后，在雙側(cè)迷走神經(jīng)刺激下，對照組6只犬均出現(xiàn)房室結(jié)結(jié)性心律；實(shí)驗(yàn)組6只犬出現(xiàn)室性心律，且心率較對照組顯著增快，心室起搏顯示室性心律來源于細(xì)胞移植部位。
　　 4.基因轉(zhuǎn)染MSCs后犬心外膜下移植，MSCs不僅在心肌內(nèi)存活，還表達(dá)mHCN4蛋白，轉(zhuǎn)GFP組及未轉(zhuǎn)染的cMSCs也在體