mHCN4基因修飾大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為心臟起搏樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景與目的：病態(tài)竇房結(jié)綜合征(簡稱病竇綜合征)臨床常見，對人體健康危害極大，且發(fā)病機(jī)理不清，也無有效防治措施。目前，病竇綜合征的治療以植入電子心臟起搏器為首選，但電子心臟起搏器價格昂貴、電池壽命有限、需要定期檢測及更換，以及植入電子心臟起搏器可發(fā)生一些難以避免的并發(fā)癥，使其應(yīng)用受限。因此，探討對病竇綜合征患者竇房結(jié)結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行修復(fù)，重建一個具有正常生理功能的“生物心臟起搏器”，以取代電子心臟起搏器治療，則是當(dāng)今心臟電生理學(xué)界研究的

2、熱點(diǎn)之一。近年來，雖有少數(shù)將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)直接或修飾后移植至生物體內(nèi)以構(gòu)建心臟起搏點(diǎn)的研究，但其結(jié)果尚不十分令人滿意，其主要問題是移植細(xì)胞在體內(nèi)存活時間短、心率增快不明顯及心率變異性低等，表明現(xiàn)有的“種子細(xì)胞”尚不能滿足構(gòu)建“生物心臟起搏器”的需要。因此，探索尋找適合構(gòu)建生物心臟起搏器的“種子細(xì)胞”，已成為當(dāng)前心臟電生理學(xué)研究的重點(diǎn)內(nèi)容之一。 既往研究表明，起搏電流(funny current，I<,f>)是心臟竇

3、房結(jié)細(xì)胞自律性產(chǎn)生與維持的決定因素，而超極化激活的環(huán)化核苷酸門控通道(HCN)基因家族則是I<,f>形成的分子基礎(chǔ)。HCN基因家族包括四個成員，即HCN1～HCN4，其中HCN4與I<,f>的形成關(guān)系最為密切。為探討mHCN4基因修飾的大鼠MSCs作為構(gòu)建生物心臟起搏器“種子細(xì)胞”的可行性，本研究在國家自然科學(xué)基金(30370585)的資助下，利用本課題組在前期研究中構(gòu)建的mHCN4基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，對大鼠MSCs進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并在體外誘

4、導(dǎo)培養(yǎng)，以期獲得具有自律性的心臟起搏樣細(xì)胞，為構(gòu)建生物心臟起搏器提供“種子細(xì)胞”。 研究方法： 1．以mHCN4逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(pMSCV-mHCN4-EGFP)及不含mHCN4的逆轉(zhuǎn)錄病毒對照載體(pMSCV-EGFP)分別轉(zhuǎn)染大鼠MSCs，并進(jìn)行嘌呤霉素加壓篩選，觀察綠熒光蛋白表達(dá)情況，并以免疫細(xì)胞化學(xué)檢測mHCN4基因表達(dá)，以全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)對重組mHCN4通道進(jìn)行動力學(xué)測定。 2．將獲得的mHCN4基因修

5、飾大鼠MSCs進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，用倒置顯微鏡進(jìn)行活細(xì)胞形態(tài)學(xué)的動態(tài)觀察。 3．用透射電鏡觀察誘導(dǎo)培養(yǎng)后細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測細(xì)胞α-actin、cTnT及Cx43的表達(dá)，用膜片鉗技術(shù)記錄細(xì)胞的動作電位。 4．對轉(zhuǎn)染mHCN4基因的大鼠MSCs與分離的普通心房肌細(xì)胞進(jìn)行混合培養(yǎng)，用透射鏡電觀察細(xì)胞間結(jié)構(gòu)連接情況；用熒光光漂白后恢復(fù)技術(shù)(FRAP)檢測細(xì)胞間通訊功能狀況。 研究結(jié)果： 1．成功將

6、mHCN4逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(pMSCV-mHCN4-EGFP)轉(zhuǎn)染至大鼠MSCs，并經(jīng)加壓篩選獲得了穩(wěn)定表達(dá)mHCN4基因的大鼠MSCs。 2．對獲得的穩(wěn)定表達(dá)mHCN4基因的大鼠MSCs進(jìn)行細(xì)胞膜片鉗檢測，可記錄到超極化激活的內(nèi)向電流，其半數(shù)最大激活電壓為-98.2±5.7mV，反轉(zhuǎn)電位是22.5±5.2mV，在-140mV指令電位時的激活時間常數(shù)為451±61ms。該電流具有明顯的時間及電壓依賴特性，且對細(xì)胞外Cs<'+>高度

7、敏感。在相同記錄條件下，僅轉(zhuǎn)染pMSCV-EGFP的大鼠MSCs及未轉(zhuǎn)染組大鼠MSCs均未記錄到明確的超極化內(nèi)向電流。 3．對mHCN4基因修飾的大鼠MSCs進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，用倒置顯微鏡進(jìn)行活細(xì)胞觀察發(fā)現(xiàn)，普通培養(yǎng)10天左右，可觀察到搏動細(xì)胞出現(xiàn)，細(xì)胞呈長桿狀，搏動頻率88-318次不等，平均202±72.9次/分，單個細(xì)胞自主搏動2-3天后停止，其收縮最明顯地部位出現(xiàn)空泡狀結(jié)構(gòu)。隨后搏動細(xì)胞不斷出現(xiàn)，呈集落生長，可觀察到短梭形、

8、單細(xì)胞核細(xì)胞搏動。GFP組細(xì)胞僅見少量長桿狀細(xì)胞出現(xiàn)，未觀察到細(xì)胞自主搏動，對照組細(xì)胞形態(tài)未見明顯變化及細(xì)胞的自主搏動。 4．選擇普通培養(yǎng)14天的搏動細(xì)胞，用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，該細(xì)胞可記錄到竇房結(jié)細(xì)胞樣的動作電位(平均最大舒張電位為-50.9±4.8mV，平均動作電位幅度為62.9±5.2mV)； 5．搏動細(xì)胞經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測，該細(xì)胞不但表達(dá)mHCN4通道，同時表達(dá)心肌特異性蛋白α-actin及cTnT；透射電

9、鏡觀察也發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞內(nèi)有明顯肌絲分布，但肌絲的排列紊亂與稀少，未見肌節(jié)樣結(jié)構(gòu)形成，胞漿內(nèi)可見豐富的顆粒、少量線粒體，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)非常相似。 6．經(jīng)檢測mHCN4基因修飾大鼠MSCs可表達(dá)Cx43，其表達(dá)水平明顯較GFP組及未轉(zhuǎn)染組高，與心房肌細(xì)胞的Cx43表達(dá)水平無明顯差異。 7．透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)到mHCN4基因修飾大鼠MSCs可與相鄰細(xì)胞間可形成指狀交錯的連接，并可觀察到縫管連接的形成。 8

10、．經(jīng)熒光光漂白后恢復(fù)技術(shù)(FRAP)檢測發(fā)現(xiàn)mHCN4陽性細(xì)胞組及mHCN4陽性細(xì)胞與心房肌細(xì)胞共培養(yǎng)組的平均熒光恢復(fù)率明顯高于GFP陽性細(xì)胞組及GFP陽性細(xì)胞與心房肌細(xì)胞共培養(yǎng)組，并與心房肌細(xì)胞組相似。 本研究結(jié)論： 1．mHCN4可成功轉(zhuǎn)染至大鼠MSCs，并可穩(wěn)定持續(xù)的表達(dá)。 2．mHCN4基因修飾的大鼠MSCs可記錄到If，表明其已具有心臟起搏細(xì)胞的電生理特性。 3．mHCN4基因修飾大鼠MSCs可