H0-1基因轉染預防慢性移植腎病的實驗研究.pdf

1、器官移植是腎臟，胰島，或心臟等慢性終末期疾病的主要治療方法。雖然免疫抑制劑的進步使移植物特別是移植腎急性排斥反應的發(fā)生率能夠得到較好的控制，但移植物長期生存率并沒有明顯改善，這主要歸結于移植物慢性失功。盡管具體的分子和細胞機制尚不清楚，但目前可以肯定非免疫因素和免疫因素在慢性移植物功能障礙的發(fā)病機理中都起重要作用。 血紅素氧化酶(HemeOxygenase,HO)是降解亞鐵血紅素為一氧化碳、膽綠素、亞鐵離子的胞內限速酶。HO有三

2、個亞型(HO-1，-2and-3)，其中HO-3結構和功能與HO-2相似，為HO的組成型，HO-1為誘導型，能在多種細胞中誘導表達，主要分布于脾、肝臟、骨髓等單核巨噬細胞系統(tǒng)。許多應激相關的刺激能夠誘導HO-1的表達，而HO-1的細胞保護作用與它的3種代謝產(chǎn)物密切相關。其中有明顯的抗炎活性的CO研究最多。在既往的動物模型研究中，HO-1能分別減輕移植物缺血/再灌注損傷和急性移植物排斥反應；在抗CD4單抗誘導同種異體移植物長期存活的動物模

3、型中，移植后早期誘導HO-1表達能夠改善抗體相關移植物動脈硬化。 慢性移植腎病(ChronicAllograftNephropathy，CAN)，是移植腎功能慢性失功的統(tǒng)稱，現(xiàn)公認非免疫因素的缺血再灌注損傷和免疫因素的排斥反應是影響移植腎長期存活的最重要兩大因素。我們在HO-1分別具有抗缺血再灌注損傷和抗排斥反應類似保護基因作用的文獻基礎上，推測其在局部高表達可以同時減輕缺血損傷和排斥反應，應對CAN的發(fā)生發(fā)展過程起到延緩的作用

4、。因而本研究中我們使用HO-1重組腺病毒將HO-1基因導入供腎中，觀察HO-1能否預防慢性移植腎病的發(fā)生發(fā)展。 目的1.構建Ad-HO-1重組腺病毒載體，并鑒定其安全性及生物活性； 2.將Ad-HO-1重組腺病毒載體感染腎小管上皮細胞(HK-2)，探討Ad-HO-1感染靶細胞的效率、目的基因表達產(chǎn)物水平及在體外對刺激人單個核細(PBMC)增殖能力的影響。 3.通過建立大鼠慢性移植腎病模型，觀察Ad-HO-1在體灌

5、注移植腎后的轉染效率及其蛋白表達情況，通過Ad-HO-1在體灌注將HO-1基因導入大鼠腎臟移植物，探討HO-1基因轉染對慢性移植腎病的預防作用。 方法本實驗分三部分進行：一、Ad-HO-1重組腺病毒載體的構建及鑒定用限制性內切酶XhoⅠ+HindⅢ從克隆載體PRH01中切出HO-1基因片段，亞克隆至經(jīng)SalⅠ+HindⅢ酶切的克隆質粒Puc18中，形成轉移質粒Puc18-PRH01，將之用KpnⅠ+HindⅢ雙酶切，再次亞克隆至

6、經(jīng)同樣酶切的質粒pAdTrack-CMV中，形成轉移質粒pAdTrack-Puc18-PRHO1，將之PmeⅠ酶切線性化后與腺病毒基因組質粒pAdEasy-1共轉化大腸桿菌BJ5183，在BJ5183菌種中進行同源重組，得到腺病毒質粒pAdEasy-HO-1，經(jīng)293細胞包裝后，擴增、濃縮，最終獲得高效、穩(wěn)定表達HO-1基因腺病毒Ad-HO-1。通過PCR、基因測序進行鑒定。 二、Ad-HO-1的細胞毒性和介導HO-1基因表達能

7、力的檢測用Ad-HO-1重組腺病毒載體轉染非包裝的HK-2細胞后，對HK-2形態(tài)和生長無明顯影響，表明Ad-HO-1安全可靠，細胞毒性小。熒光顯微鏡直接觀察GFP在上述細胞中的表達，結果37℃下Ad-HO-1轉染該細胞GFP陽性表達率達90％以上；以WesternBlot檢測Ad-HO-1轉染的HK-2細胞，結果顯示有HO-1蛋白條帶，而未轉染細胞相應位置無此條帶，表明Ad-HO-1可轉染非包裝細胞并表達目的蛋白，進一步證明載體構建正確

8、。通過感染腺病毒的HK-2細胞與人外周血單個核細胞的培養(yǎng)顯示Ad-HO-1能夠在體外有效的降低T細胞的增殖反應。 三、Ad-HO-1對大鼠慢性移植腎病的預防作用采用在體灌注的方法實現(xiàn)了Ad-HO-1對移植腎的有效轉染。冰凍切片觀察GFP熒光主要在腎小管和間質部位，腎小球轉染率低?；蜣D染供體腎后行F344-LEW腎移植顯示：腎臟HO-1于移植后第3天即有表達，轉染后1～2周表達最強。腎移植術后16周移植腎病理Banff評分及免疫

9、組化結果顯示：HO-1的基因轉染能減緩移植腎的腎小球硬化和間質纖維化的進程，對大鼠慢性移植腎病具有一定的預防作用。 結論1.采用DNA重組技術，成功構建了重組腺病毒Ad-HO-1； 2.經(jīng)PCR、熒光顯微鏡等檢測表明：重組腺病毒Ad-HO-1能高效、穩(wěn)定的表達HO-1目的基因和具有良好的安全性； 3.在體外功能試驗中，感染腺病毒的腎小管上皮細胞(HK-2)不僅生長形態(tài)狀況無顯著變化，而且在腺病毒感染HK-2平均感

10、染復數(shù)(MOI)為0.01、O.1時對人外周血單8個核細胞的增殖反應具有顯著的抑制作用，提示HO-1可能通過調節(jié)T細胞激活和增殖的方式抑制移植物排斥反應。 4.在大鼠體內實驗中，對供腎在體原位灌注Ad-HO-1，檢測發(fā)現(xiàn)移植腎腎小管第3天有目的蛋白表達，且持續(xù)2～4周，在體基因灌注具有較高的轉染效率。 5.Ad-HO-1轉染移植腎后，移植腎α-SMA、TGF-β及PDGFB表達減低，腎臟病理損傷及移植腎纖維化減輕，移植腎