轉染HCN4基因的犬骨髓間充質干細胞同種異體移植對傳導阻滯心臟電生理變化的影響.pdf

1、背景與目的:
　　生物起搏(BiologicalPacemaker)是利用細胞技術和基因技術,將目的基因(起搏基因或可促進心臟自主節(jié)律的基因)直接導入心臟或者利用各種起搏/非起搏細胞將起搏電流傳遞至疾病的心臟,使其能在局部發(fā)揮其接近生理狀態(tài)的起搏或提高心率的作用。本研究擬通過基因轉染技術和細胞治療技術,利用骨髓間充質干細胞(MSCs)作為傳遞起搏電流的細胞平臺,試圖在動物體內“構建”生物心臟起搏器,以探索治療緩慢型心律失常疾病的新

2、方法。本研究是在本課題組前期研究的基礎上,結合國內外這一領域研究的最新成果,就小鼠HCN4基因(mHCN4)轉染犬骨髓間充質干細胞(cMSCs)同種異體移植對完全性房室傳導阻滯(CAVB)心臟電生理改變的影響進行探索。包括以下三方面內容:(1)利用攜帶mHCN4基因的慢病毒載體(Lentiviral-mHCN4),將mHCN4基因轉染到cMSCs,體外構建可表達功能性起搏通道的起搏樣干細胞(Lv-mHCN4-cMSCs);(2)將構建好

3、的起搏樣干細胞(mHCN4-cMSCs),同種異體移植到已植入電子心臟起搏器的CAVB模型犬心室肌內,通過監(jiān)測全天心律、運動變時性研究、神經(jīng)遞質反應性研究、組織學和分子生物學等,評價細胞移植對傳導阻滯心臟心室自律性的影響;(3)將mHCN4-cMSCs同種異體移植到CAVB模型犬心室肌內,觀察其對傳導阻滯心臟的致心律失常相關電生理參數(shù)的改變有無影響,以探索和評價利用mHCN4-cMSCs心室移植增強傳導阻滯心臟生物起搏功能的安全性和臨床

4、應用可行性。
　　方法:
　　1.利用構建好的Lentiviral-EGFP-mHCN4慢病毒載體進行293T細胞病毒包裝,將mHCN4基因轉染到第2-3代cMSCs,得到Lentiviral-EGFP-mHCN4-cMSCs(HCN4組細胞,以下簡稱mHCN4-cMSCs);對照組cMSCs只轉染Lentiviral-EGFP,得到EGFP-cMSCs。待熒光顯微鏡觀察到兩組cMSCs穩(wěn)定表達HCN4通道蛋白和綠色熒光蛋白

5、(GFP)后,利用全細胞膜片鉗技術對兩組轉染陽性的cMSCs進行通道電生理學研究。
　　2.取成年犬射頻消融希氏束建立完全性房室傳導阻滯(CAVB)動物模型,并在頸部皮下植入電子起搏器。1周后對模型犬進行開胸手術,將mHCN4-cMSCs(HCN4組)或EGFP-cMSCs(對照組)懸液斜行注入左心室前壁(第一對角支和第二對角支之間區(qū)域)處心外膜下,并在該處心外膜進行超速起搏,做好標記。
　　3.術后對各組模型犬的心室自律性

6、和移植部位組織目的基因蛋白表達進行綜合檢測和分析。主要采用體表心電圖QRS波形分析、24小時動態(tài)心電圖心律變化記錄、起搏器活動日志記錄分析、其對于神經(jīng)體液調節(jié)和體能運動的反應能力評估心室自律性變化;用組織病理學HE染色、免疫組織熒光染色技術和WesternBlot分子生物學技術等多項技術方法對細胞移植后體內存活和目的基因蛋白表達進行檢測。
　　4.另取健康成年犬開胸,于心外膜直視下用程序電刺激(PES)的方法測定其各局部(左室前壁

7、擬注射細胞部位、右室前壁、左室游離壁下部)心臟電生理基礎參數(shù),包括:舒張期起搏閾值(DPT)、心室有效不應期(VERP)、心室有效不應期差值(ΔVERP)、單項動作電位時程(MAPD)、單項動作電位時程差值(ΔMAPD)、室顫閾值(VFT)。測定之后做好注射部位標記,在標記處附近注射mHCN4-cMSCs(HCN4組)、EGFP-cMSCs(cMSCs對照組)和生理鹽水(鹽水組),然后關胸。
　　5.1周后對HCN4組和細胞對照組

8、犬制備CAVB模型,鹽水對照組不進行CAVB制作,術后每96小時檢查24小時動態(tài)心電圖。4周后各組再次開胸行PES測定心臟電生理參數(shù),處死動物,取材利用組織病理學HE染色、免疫組織化學染色、westernblot技術檢測移植部位細胞存活和HCN4蛋白表達及移植部位邊緣心室肌縫隙連接蛋白43(CX43)表達情況。
　　結果:
　　1.慢病毒載體Lentiviral-EGFP-mHCN4經(jīng)包裝后轉染第3-4代犬骨髓間充質干細胞的

9、轉染陽性率約為65％,經(jīng)免疫熒光染色技術測定其膜表面可表達HCN4蛋白,經(jīng)多次傳代后細胞生長狀態(tài)依然良好,仍可表達HCN4蛋白。
　　2.利用全細胞膜片鉗技術對轉染陽性的細胞進行電生理研究,能夠記錄到類似If特性的細胞膜通道離子電流。該電流具備超極化鉗制電壓激活和時間依賴的特點,對細胞內cAMP反應良好,符合起搏電流If的典型特征。而EGFP對照組細胞(轉染lentiviral-EGFP)檢測不出類似特性的電流。
　　3.將

10、mHCN4-cMSCs(HCN4組)和EGFP-cMSCs(對照組)移植到已植入電子心臟起搏器的CAVB模型犬的左心室心外膜下。在移植后第2周內,24小時動態(tài)心電圖及每周體表心電圖檢查提示HCN4組8只犬中有6只出現(xiàn)起源于左室的自主心律,占總心搏數(shù)的比例高于60%;并且在第2周末時犬運動時最大心率達到最高103±12bpm(對照組為50±3bpm),同時休息時的靜息心率和平均心率也隨著時間逐漸增加,到第4周時趨于穩(wěn)定(基礎心率55±6b

11、pm,平均心率59±5bpm)。且明顯高于對照組對應心率指標(基礎心率27±2bpm,平均心率38±2bpm)。HCN4組電子起搏率從第2周開始下降,到第4周時下降至6±2%,而對照組則為57±7%。通過神經(jīng)遞質反應性測試證實,這一異位起搏心律對阿托品無明顯反應,但對腎上腺素反應良好,同時對生理性體能運動也有良好的變時性。
　　4.用組織病理學、免疫熒光化學染色和分子生物學技術檢測細胞移植部位的心室肌標本,證實移植的MSCs細胞能

12、夠在移植部位存活至少6周,局部未發(fā)現(xiàn)明顯的細胞凋亡壞死和免疫排斥反應。免疫熒光組織化學研究證實異體移植的MSCs細胞能夠在移植部位有效表達HCN4通道蛋白,且其表達量明顯超過注射未轉染基因的對照組。
　　5.心臟電生理參數(shù)測定結果顯示犬在模型制備前各組間參數(shù)無顯著差異;細胞移植+CAVB模型后4周細胞對照組QT、QTc、DPT、VERP、MAPD顯著高于鹽水對照組(P<0.01)和HCN4組(P<0.05),ΔVERP、ΔMAPD

13、顯著高于鹽水對照組(P<0.01),VFT低于鹽水對照組(P<0.01)和HCN4組(P<0.05);HCN4組ΔVERP、ΔMAPD顯著高于細胞對照組(P<0.01),VFT高于細胞對照組(P<0.05)。
　　結論:
　　1.利用慢病毒載體可在體外穩(wěn)定轉染mHCN4基因至犬骨髓間充質干細胞。轉染陽性的細胞可穩(wěn)定表達HCN4通道蛋白。全細胞膜片鉗技術對轉染陽性細胞進行膜通道電流檢測,證實其在體外培養(yǎng)環(huán)境下可表達對cAMP反

14、應敏感的起搏樣電流IHCN4,因此我們把這種細胞稱為起搏樣干細胞mHCN4-cMSCs。
　　2.將mHCN4-cMSCs同種異體移植到完全性房室傳導阻滯犬心室肌后,能在機體內存活達6周,且在體內繼續(xù)表達HCN4蛋白,并可有效提高移植部位的室性自主節(jié)律,減少電子起搏器依賴,并且這種生物起搏心律具有良好的變時性和神經(jīng)遞質反應性。
　　3.健康犬在心臟傳導阻滯后其心室電生理特性明顯改變,各致心律失常敏感性指標均高于健康狀態(tài);在心