慢病毒介導的HGF基因修飾骨髓間充質(zhì)干細胞對大鼠同種異體肝移植的影響.pdf

1、本研究中將HGF基因通過慢病毒載體介導穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MSC，對MSC進行修飾，利用MSC歸巢效應定位于移植肝，長期分泌HGF，形成一個免疫抑制的微環(huán)境，增強MSC的免疫抑制功能，發(fā)揮HGF調(diào)節(jié)免疫和組織修復的功能，取得協(xié)同效應，減輕排斥反應，延長移植物存活時間，為肝移植急性排斥提供新的治療策略。 第一部分改良式大鼠同種異體原位肝移植模型的建立 目的：探討改良“二袖套法”原位大鼠肝移植模型的建立。方法：SD大鼠為供、受體的同基因

2、肝移植70只(SD-SD組)，SD、Wistar分別為供、受體的同種異體肝移植60只(SD-Wistar組)。采用改良的“二袖套法”進行大鼠原位肝移植，充分暴露第一肝門，不翻動肝臟先行門靜脈灌注。在體一步法離斷肝上下腔靜脈，不帶膈肌環(huán)。吻合肝上下腔靜脈采用單線連續(xù)縫合；雙線牽引法安裝門靜脈袖套。術(shù)后充分補液維持大鼠血液動力學穩(wěn)定。結(jié)果：供體手術(shù)時間(38.2±2.5)min，受體手術(shù)時間(45.6±3.5)min，無肝期(15.1±2.

3、2)min，手術(shù)成功率93％，1周存活率92％，與傳統(tǒng)二袖套法比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。SD-SD組手術(shù)成功64只，受體長期存活，術(shù)后肝功能很快恢復正常，肝組織病理無明顯變化。SD-Wistar組手術(shù)成功57只，受體存活時間8-20d，平均10.5d。大鼠于術(shù)后3-5d出現(xiàn)急性排斥反應，未經(jīng)處理后均死亡。結(jié)論：改良式大鼠原位肝移植操作簡便、成功率高、易于復制，是肝移植實驗穩(wěn)定可靠的動物模型。SD-Wistar大鼠組合是一組高

4、排斥的肝移植模型，可發(fā)生典型的急性免疫排斥反應。 第二部分骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)鑒定及在移植肝內(nèi)定居能力的觀察 目的:體外分離培養(yǎng)擴增大鼠骨髓間充質(zhì)于細胞(MSC)，并進行鑒定，觀察其在肝移植受體內(nèi)的定居能力。方法：利用直接貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)大鼠MSC，并傳代擴增，相差顯微鏡下觀察生長特性。繪制細胞生長曲線。流式細胞儀檢測細胞表面標志。定向誘導MSC向成骨和成脂肪分化，鑒定其多向分化潛能。DAPI熒光標記MSC，由門靜脈

5、注入同種異體肝移植后受體內(nèi)，取肝組織冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察其在移植肝內(nèi)的定居情況。結(jié)果：直接貼壁法成功分離培養(yǎng)MSC，并在不斷的傳代培養(yǎng)中得以純化擴增。細胞生長旺盛，形態(tài)呈梭狀，均勻分布的漩渦狀生長。傳代周期5d左右，可在體外傳代20代以上，具有強大的增殖能力。流式細胞儀檢測第3代的MSC表面標志，CD44、CD90分別為94.81％，99.53％，呈陽性高表達。CD34、CD45、CD11b分別為0.04％、1.94％、1.42

6、％，呈陰性表達，符合MSC表型。在成骨和成脂的誘導劑條件下，MSC可成功分化為成骨和脂肪細胞，具有多向分化的能力。DAPI標記MSC的陽性率達100％。倒置熒光顯微鏡下觀察，可見藍色熒光標志的MSC定位于移植肝內(nèi)。結(jié)論：直接貼壁法分離培養(yǎng)MSC簡單易行，獲得MSC純度高，生物學特性穩(wěn)定。MSC可以在移植肝內(nèi)存活并定居。 第三部分肝細胞生長因子慢病毒的構(gòu)建及對骨髓間充質(zhì)干細胞的修飾 目的:構(gòu)建攜帶人肝細胞生長因子(hHGF

7、)基因的慢病毒，感染MSC，觀察hHGF基因修飾的MSC細胞(MSC/hHGF)的生物學行為，體外檢測MSC/hHGF的免疫抑制作用。方法：從含hHGF基因的質(zhì)粒中，PCR法獲取hHGF全長基因，與慢病毒載體分別進行酶切，產(chǎn)物定向連接，轉(zhuǎn)化后行PCR鑒定和測序，構(gòu)建hHGF慢病毒表達質(zhì)粒。脂質(zhì)體介導慢病毒載體三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞。收集病毒超濾離心濃縮，實時定量PCR測定滴度。將hHGF慢病毒感染MSC，熒光顯微鏡觀察熒光表達，流式細

8、胞儀檢測慢病毒感染的效率，ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清hHGF分泌水平，細胞RT-PCR檢測hHGF的mRNA表達。體外混合淋巴細胞反應(MLR)檢測MSC和MSC/hHGF兩組細胞的免疫抑制作用。結(jié)果：成功構(gòu)建攜帶hHGF基因的慢病毒，滴度達到1×108TU/ml。hHGF慢病毒高效率感染MSC，最佳MOI值=10。流式細胞儀檢測感染效率達98％。熒光表達強，在感染后28d MSC仍穩(wěn)定表達強烈的綠色熒光。培養(yǎng)上清可檢測到hHGF因子

9、，在第5d左右達到高峰，可達40.5ng/ml，這種高水平分泌可持續(xù)到感染后第28d。RT-PCR檢測出hHGF mRNA表達。MSC組顯著抑制淋巴細胞的增殖，抑制率達46.34％。而MSC/hHGF組抑制率可達64.42％，具有更強的抑制效應。結(jié)論：通過慢病毒載體將hHGF基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至MSC細胞，基因整合到MSC基因組中，并正確轉(zhuǎn)錄和表達。hHGF基因修飾的MSC獲得了更強的免疫抑制作用，說明hHGF與MSC在體外具有免疫抑制協(xié)同作

10、用。 第四部分慢病毒介導hHGF基因修飾MSC對大鼠同種異體肝移植免疫排斥的影響 目的：觀察慢病毒介導hHGF基因修飾的MSC(MSC/hHGF)在大鼠體內(nèi)對同種異體肝移植的免疫排斥反應的影響，探討其誘導免疫耐受的機制。方法：建立穩(wěn)定的同種異體肝移植模型，受體移植成功后，MSC/hHGF組立即經(jīng)門靜脈注入2x106/ml的MSC/hHGF1ml。MSC/GFP組注入2x106/ml的MSC/GFP1ml。MSC組注入2x

11、106/ml的MSC1ml。對照組注入Iml生理鹽水。觀察生存時間，移植后7d時檢測肝功能，取肝臟組織行病理學檢查，ELISA方法檢測受體血清中hHGF、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ等細胞因子的水平，Tunel法檢測肝組織內(nèi)細胞凋亡情況，免疫組化檢測TNF-α、NF-K B、Bc1-2、PCNA在肝組織內(nèi)的表達，RT-PCR檢測肝組織內(nèi)hHGF、TNF-α、NF-K B和Bc1-2 mRNA的表達。結(jié)果：RT-PCR證實M

12、SC/hHGF組肝組織內(nèi)有hHGF基因轉(zhuǎn)錄，并檢測到綠色熒光表達，ELISA檢測血清中hHGF水平可達6.2ng/ml。MSC/hHGF組生存時間>100d，MSC/GFP組23.1±3.9d，MSC組23.4±3.1d，均顯著長于對照組(10.5±4.2d)。MSC/hHGF組和MSC組均能減輕急性排斥反應，改善受體狀況。相比MSC組，MSC/hHGF組療效更顯著，肝功能明顯改善，病理學無急性排斥反應或僅輕度，IL-2、IFN-γ水平

13、降低，IL-4、IL-10水平升高，細胞凋亡明顯減少，Bc1-2表達和PCNA表達顯著升高。TNF-α和NF-K B表達明顯減少。結(jié)論：通過門靜脈輸注MSC/hHGF到大鼠同種異體移植肝內(nèi)是有效可行的，成功誘導出免疫耐受。與單純應用MSC比較，MSC/hHGF在移植肝局部形成分泌高濃度hHGF免疫抑制微環(huán)境，能更顯著抑制急性排斥反應，延長移植受體的存活時間。hHGF與MSC的免疫抑制協(xié)同作用與誘導Th1細胞向Th2細胞偏移、減少致炎因子