胚胎小體制備新方法的建立及小鼠胚胎干細(xì)胞體外分化形成新生血管的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)通過采用先貼壁培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞3d，再懸浮培養(yǎng)的策略，探討建立一種制備胚胎小體的新方法。此外，通過在體外建立小鼠胚胎干細(xì)胞二維和三維分化體系，探討小鼠胚胎干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化并形成新生血管的條件及特點(diǎn)，為進(jìn)一步研究血管發(fā)育機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 研究方法： 1.細(xì)胞培養(yǎng)制備原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(primarymouseembryonicfibroblast,PMEF)，凍存后備用。小鼠ES細(xì)胞株R1培養(yǎng)于經(jīng)10μg/mL絲

2、裂霉素C(mitomycinC，MMC)處理2h的飼養(yǎng)層細(xì)胞STO(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞株)及PMEF上。當(dāng)ES細(xì)胞生長(zhǎng)至亞融合狀態(tài)時(shí)進(jìn)行傳代，每天換液以維持其未分化狀態(tài)。 2.貼壁法制備EBs當(dāng)ES細(xì)胞R1生長(zhǎng)至70﹪～80﹪亞融合時(shí)，將其消化成單個(gè)細(xì)胞，以1×106的細(xì)胞數(shù)接種到100mm組織培養(yǎng)皿中，用含低濃度LIF(1ng/mL)的ES細(xì)胞培養(yǎng)液連續(xù)貼壁培養(yǎng)3d后，收集貼壁細(xì)胞團(tuán)，繼續(xù)在EBs培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)。 3

3、.EBs形態(tài)學(xué)觀察相差顯微鏡下觀察不同發(fā)育階段該方法得到的懸浮生長(zhǎng)EBs的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)；收集不同階段的EBs行冰凍切片，觀察EBs內(nèi)部結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。 4.EBs分化能力測(cè)定分別對(duì)懸浮培養(yǎng)EBs的冰凍切片及貼壁分化EBs的細(xì)胞爬片行三個(gè)胚層標(biāo)志物的免疫熒光染色，包括內(nèi)胚層標(biāo)志物甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)，中胚層標(biāo)志物血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子(plateletendothelialcelladhesionmolecule

4、-1,PECAM-1)以及外胚層標(biāo)志物神經(jīng)絲蛋白68KD(neurofilament68KD，NF-68)，觀察兩種分化狀態(tài)下三胚層標(biāo)志物的表達(dá)情況。 5.二維分化體系中ECs分化及血管形成情況的觀察二維分化體系的建立：生長(zhǎng)至第5d的EBs置于0.1﹪明膠包被的蓋玻片上培養(yǎng)使其貼壁分化；對(duì)貼壁分化的細(xì)胞行Dil-Ac-LDL標(biāo)記及PECAM-1免疫熒光染色，觀察ECs分化及血管形成情況。 6.三維分化體系中ECs分化及血

5、管形成情況的觀察三維分化體系的建立：包括懸浮培養(yǎng)的EBs體系及三維Ⅰ型膠原培養(yǎng)體系。前者是將EBs一直懸浮培養(yǎng)，后者是將EBs在含有生長(zhǎng)因子混合物的培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)11d，然后接種到1mg/mL的Ⅰ型膠原中；將懸浮培養(yǎng)的EBs體系中的EBs行冰凍切片，PECAM-1免疫熒光染色后用激光共聚焦顯微鏡行圖像三維重構(gòu)，觀察形成血管的三維結(jié)構(gòu)。倒置相差顯微鏡下觀察Ⅰ型膠原培養(yǎng)體系中的細(xì)胞EBs出芽情況。 研究結(jié)果： 1.ES細(xì)胞

6、形態(tài)特征ES細(xì)胞在STO及PMEF飼養(yǎng)層上均保持未分化狀態(tài)，形成致密的細(xì)胞集落，集落邊緣光滑，內(nèi)部看不清細(xì)胞邊界。但二者也有差別，在STO上，ES細(xì)胞生長(zhǎng)較慢，以圓形集落為主；在PMEF上，ES細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，以橢圓形集落為主。 2.EBs的形成貼壁培養(yǎng)3d后，可見大量EBs形成，形成率40﹪左右，EBs大小均一，EBs周圍可見部分內(nèi)胚層細(xì)胞分化。 3.EBs各發(fā)育階段的形態(tài)結(jié)構(gòu)EBs經(jīng)懸浮培養(yǎng)后迅速分化，1d～2d后可形

7、成典型的簡(jiǎn)單EBs(simpleembryoidbodies，SEBs)，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，SEBs進(jìn)一步分化形成成熟囊性EBs(cysticembryoidbodies，CEBs)，CEBs具有類似早期胚胎的原始內(nèi)胚層、基底膜、柱狀原始外胚層及囊腔等結(jié)構(gòu)。 4.EBs具有分化為三個(gè)胚層來源細(xì)胞的能力無論是懸浮培養(yǎng)EBs的冰凍切片還是貼壁分化EBs的細(xì)胞爬片，其三胚層標(biāo)志物AFP、PECAM-1及NF-68免疫熒光染色結(jié)果均為陽性

8、，說明應(yīng)用本方法所獲EBs具有較完全的分化能力。 5.二維分化體系中ECs分化及血管形成情況在二維分化體系，ES細(xì)胞在無外源性生長(zhǎng)因子存在的條件下可自發(fā)向ECs分化，ECs主要定位在分化細(xì)胞密集處，分化表現(xiàn)為三種形式：ECs呈集落樣生長(zhǎng)，不形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；ECs互相連接形成僅在熒光顯微鏡下可以識(shí)別的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；ECs互相連接形成在相差顯微鏡和熒光顯微鏡下均可識(shí)別的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。在二維分化體系中，相差顯微鏡下還可見到三種其他形態(tài)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)

9、，經(jīng)PECAM-l免疫熒光染色證實(shí)并非ECs網(wǎng)，說明并非所有光鏡下可見的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)均為ECs網(wǎng)。 6.三維分化體系中ECs分化及血管形成情況在三維的懸浮EBs培養(yǎng)體系，ECs的分化不依賴于外源性生長(zhǎng)因子，分化表現(xiàn)為條索狀結(jié)構(gòu)、管腔樣結(jié)構(gòu)及排列紊亂的細(xì)胞團(tuán)三種形式。對(duì)該EBs的冰凍切片進(jìn)行的三維圖像重構(gòu)顯示，EBs中有大量的血管網(wǎng)形成。在三維的Ⅰ型膠原培養(yǎng)體系中，ES形成的EBs表現(xiàn)為出芽式血管新生，這一過程依賴于外源性生長(zhǎng)因子混合