煙草CN基因調(diào)控植株抗TMV機理研究.pdf

1、煙草普通花葉病毒(tobacco mosaic virus,TMV)是Togaviridae科Tobamo-virus組的單鏈RNA(signal strand RNA,ssRNA)病毒,可侵染包括茄科植物在內(nèi)的350多種植物。煙草是茄科植物中具有特殊地位的經(jīng)濟作物,敏感煙草感染TMV后可引起30-50％損失,嚴(yán)重的甚至絕收。據(jù)統(tǒng)計,全世界每年僅因MV危害造成的損失就高達(dá)1億美元,而TMV在我國吉林、河南、山東、貴州、云南等省的煙草種植

2、區(qū)均有發(fā)生,田間發(fā)病率一般在5-20%。貴州作為全國的第二大烤煙種植大省,廣泛種植有南江3號、貴煙4號、云煙87、K326、云煙97等重要的烤煙品種。其中,僅K326品種在2012年的種植面積就近1.22萬公頃,占貴州烤煙總種植面積的33.8%,但該品種易感TMV,可造成極大的損失,據(jù)統(tǒng)計貴州每年因TMV造成的損失就高達(dá)0.32億元。利用TMV抗性基因(resistance gene)進(jìn)行抗性育種是最為經(jīng)濟、安全、長效的方法之一。本研究

3、以黃花煙(N.rustica L.)來源的抗性CN作為抗源,構(gòu)建了3個含CN基因的植物表達(dá)載體pSH-CN,pGM626-DL-SAF-UCn和pSH737-U4Cn-RcHak并分別對K326進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,對篩選獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行人工接種TMV,分析轉(zhuǎn)基因植株應(yīng)答TMV侵染后的表現(xiàn)和探討CN基因介導(dǎo)的抗病機理。主要獲得如下結(jié)果:
　　1.轉(zhuǎn)CN基因煙草接種TMV后引起了接種葉片產(chǎn)生超敏反應(yīng)(hypersensitive,HR)

4、,降低了脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量,延緩了由于TMV繁殖擴散所引起的花葉斑形成和葉綠素含量下降,表明CN基因的導(dǎo)入可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生HR,在接種葉片形成壞死斑(necrosis spots),從而限制病毒的擴散,延緩病毒引起的植株系統(tǒng)感染;同時,轉(zhuǎn)基因植株應(yīng)答TMV感染時,可顯著降低MDA含量,更好地保護(hù)植物細(xì)胞免遭質(zhì)膜過氧化產(chǎn)物的損害,提高植株細(xì)胞對病原菌的防御能力;另外,CN基因的導(dǎo)入引起了植株

5、產(chǎn)生了系統(tǒng)超敏反應(yīng)(systemic hypersensitive, SHR), SHR的發(fā)生亦可提高植株對其它入侵病原菌的系統(tǒng)抗性;
　　2.接種TMV后,轉(zhuǎn)基因植株中的抗氧化酶(antioxidant enzymes,AOEs),包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD),過氧化物酶(peroxidase,POD)和過氧化酶(catalase)的酶活性均顯著增加,說明轉(zhuǎn)基因植株在防衛(wèi)TMV侵染時可通

6、過顯著提高AOEs活性來實現(xiàn)自身對入侵病毒的抵抗力。AOEs活性高低一般認(rèn)為與機體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量正相關(guān),植物體受到生物或非生物脅迫時通?？梢鹌潴w內(nèi)ROS的迅速增加,而高ROS含量會嚴(yán)重導(dǎo)致細(xì)胞受損。因此,轉(zhuǎn)基因植株接種TMV后一方面通過提高AOEs活性使植物細(xì)胞免遭ROS的氧化損傷,保護(hù)其完整性,提高植物組織對病原菌的防衛(wèi)能力,一方面高的AOEs活性對于調(diào)節(jié)以抗性基因介導(dǎo)的抗病

7、應(yīng)答通路啟動也十分重要;
　　3.轉(zhuǎn)基因植株在接種 TMV后引起了植物體內(nèi)過氧化氫(hydrogen peroxide)和水楊酸(salicylic acid,SA)含量的顯著增加,兩者在抗性基因(resistance gene,R)介導(dǎo)的抗病應(yīng)答信號通路中作為信號分子調(diào)控或激活下游抗病基因的表達(dá)。H2O2的積累與AOEs活性增加有關(guān),病原菌的侵入后導(dǎo)致植物體 O·2-迅速增加,SOD可催化O·2-形成H2O2,進(jìn)而減小由于O·2

8、-的過剩積累所引起的組織氧化損傷;H2O2可作為POD和CAT的底物被進(jìn)一步代謝,前者主要利用H2O2氧化多種底物,如酚類,乙醇和甲醛等,起到毒害物質(zhì)(H2O2)脫毒的作用;后者可直接將催化H2O2形成H2O。TMV接種初期, CN基因顯著提高了轉(zhuǎn)基因植株中AOEs的活性;接種后期,轉(zhuǎn)CN基因植株又顯著降低了CAT酶活性, CAT酶活性的降低引起了H2O2含量增,后者在植物產(chǎn)生HR和系統(tǒng)獲得抗性(systemic acquired re

9、sistance,SAR)中起到重要作用。TMV接種引起轉(zhuǎn)基因植株SA含量的顯著增加,而SA又可作為內(nèi)源信號分子調(diào)控植株的抗病應(yīng)答機制啟動,已有研究表明SA可結(jié)合于病程相關(guān)蛋白基因PR-1a啟動子序列的類as-1調(diào)控區(qū),從而啟動該基因表達(dá)提高植株對病原菌的防御能力;
　　4. TMV接種后,CN基因誘導(dǎo)了抗病應(yīng)答信號通路中蛋白組分,如CN(N-like protein)、RAR1(required for MLa12 resist

10、ance)、STG1(suppressor of G2 alleleof skp1)、MEK1(mitogen-activated protein kinase kinase)、NTF6(mitogen-activated protein kinase)、PR-1a(pathogenesis-related proteins1a),和轉(zhuǎn)錄因子WRKY1表達(dá)量的顯著上調(diào)。一般認(rèn)為,病原菌入侵后其無毒基因(avirulence,Avr)編碼

11、產(chǎn)物可與植物體內(nèi) R基因編碼的產(chǎn)物以―R-Avr的方式形成復(fù)合物,進(jìn)而調(diào)控下游抗病相關(guān)基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活。轉(zhuǎn)基因植株接種 TMV后,引起了CN基因表達(dá)量的顯著上調(diào),說明TMV入侵誘導(dǎo)TMV-Avr-CN復(fù)合蛋白的形成,之后蛋白組分RAR1和STG1的表達(dá)量也顯著增加,表明Avr-CN復(fù)合蛋白可進(jìn)一步與STG1和RAR1結(jié)合形成原初―病原菌-宿主復(fù)合蛋白調(diào)控下游抗病基因的表達(dá)。在STG1和RAR1表達(dá)量上調(diào)之后,其他蛋白組分NTF6、M

12、EK1和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量也隨之增加,說明該復(fù)合蛋白在激酶磷酸化作用經(jīng)由促分裂原活化蛋白激酶級聯(lián)途徑信號通路(mitogen-activated protein kinase cascades,MAPK cascades)調(diào)控下游PRs的表達(dá),從而實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株對TMV的控制;
　　5.本研究通過植物表達(dá)載體 pGM626-DL-SAF-UCn對煙草進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,分析外源基因,包括篩選報告基因Bar:GUS、重組酶(recombin

13、ase)基因FLP和抗病基因CN在轉(zhuǎn)基因煙草植株中的清除情況。隨著轉(zhuǎn)基因煙草葉片逐漸衰老成熟,煙葉對除草劑草銨膦(phosphinothricin,PPT)敏感性逐漸增加,對GUS(β-glucuro-nidase)染色活性逐漸下降,說明轉(zhuǎn)基因煙草植株中―Gene-deletor system實現(xiàn)了包括Bar:GUS, FLP和CN在內(nèi)的所有外源基因的清除。―Gene-deletor技術(shù)的應(yīng)用為創(chuàng)制培育無選擇標(biāo)記、抗病煙草新種質(zhì)提供理論

14、基礎(chǔ);
　　6.利用pSH737-U4Cn-RcHak對煙草K326進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化不僅通過CN基因介導(dǎo)的抗病應(yīng)答機制提高轉(zhuǎn)基因煙草植株對TMV的抗性,而且煙草高親和鉀離子轉(zhuǎn)運蛋白(high-affinity potassium transport,HAK)的共同導(dǎo)入增加了轉(zhuǎn)基因植株的葉片厚度,減小了接種葉抗病斑的大小。說明CN和HAK的協(xié)同表達(dá)不僅提高了轉(zhuǎn)基因植株對 TMV的內(nèi)部防御(CN介導(dǎo)的抗病調(diào)控),同時也增強植株對TMV的體