PRRSV CH-1a株致弱過程中的遺傳變異分析及CH-1R株全長cDNA分子克隆的構(gòu)建.pdf

1、本研究選擇了PRRSVCH-1a株致弱過程中的4個(gè)不同代次進(jìn)行了全基因組序列的測(cè)定與分析，并進(jìn)行了PRRSVCH-1R全長cDNA分子克隆的構(gòu)建。 PRRSVCH-1a致弱過程中的4個(gè)代次分別命名為P39，P71，P148和P171，并對(duì)這4個(gè)代次進(jìn)行了全基因組序列的測(cè)定。應(yīng)用相關(guān)的分子生物學(xué)軟件對(duì)其序列及其編碼產(chǎn)物進(jìn)行了分析。序列測(cè)定結(jié)果表明，PRRSVCH-1a株致弱過程中4個(gè)不同代次的Nsp2蛋白和3'UTR區(qū)域的變異相對(duì)

2、較大，尤其是Nsp2蛋白的變異，該蛋白可能具有種屬特異性功能，具有耐受堿基插入、缺失和變異的能力。同祖代毒CH-1a株相比，4個(gè)代次的Nsp2蛋白存在多處核苷酸的改變，同時(shí)位于3'UTRpoly(A)尾巴的上游的高度保守的八核苷酸序列較祖代毒也發(fā)生了改變，該基元序列對(duì)RdRp的識(shí)別及病毒復(fù)制的啟動(dòng)可能起著重要的作用，其生物學(xué)意義有待進(jìn)一步驗(yàn)證。 設(shè)計(jì)并合成了覆蓋PRRSVCH-1R株基因組的七對(duì)引物，采用RT-PCR方法，分別擴(kuò)

3、增各基因片段。通過沉默突變引入一個(gè)分子標(biāo)記(NheI識(shí)別位點(diǎn))以便于將來區(qū)分自然毒株和基因工程毒株。利用限制性內(nèi)切酶，分別消化各基因擴(kuò)增片段和pBluescriptⅡSK(+)載體，構(gòu)建PRRSVCH-1R株基因組的全長cDNA分子克隆(pB1-CH-1R)。采用PCR、限制性內(nèi)切酶酶切法和基因組測(cè)序法對(duì)pB1-CH-1R進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明已成功構(gòu)建了PRRSVCH-1R株的全長cDNA分子克隆。它不僅含有PRRSVCH-1R株的全基因