結核性胸積液腺苷脫氨酶2(ADA-,2-)升高與巨噬細胞關系的研究.pdf

1、背景與目的：在我國，結核病是引起胸積液的第一大病因，腫瘤是引起胸積液的第二大病因。胸積液腺苷脫氨酶(ADA)活性測定已成為I臨床上結核性胸積液診斷和鑒別診斷普遍使用的指標，尤其是用于結核和腫瘤性胸積液的鑒別診斷。
　　 ADA作用是催化腺苷脫氨轉化為次黃苷，ADA有2種同工酶，即ADAi和ADA2。ADA2是由位于22號染色體的CECR1編碼。ADA1和ADA2的不同生化特性，使它們能在不同的環(huán)境下發(fā)揮作用。ADA的作用底物腺苷

2、是用于合成三磷酸腺苷(ATP)、一磷酸腺苷(AMP)、脫氧腺苷等物質的重要中間體。腺苷還是一種重要的內源性信號轉導分子，產生多種生理及病理作用。在生理狀態(tài)下，細胞內外的腺苷濃度很低。在各種應激情況下，腺苷濃度大幅度上升，從而激活各種腺苷受體發(fā)揮對免疫應答及炎性反應的調控作用。而ADA通過催化腺苷，調節(jié)腺苷濃度起作用。結核性胸積液ADA升高的原因還不明確，一種觀點認為是淋巴細胞分泌ADA所致；另一種觀點認為是由單核巨噬細胞分泌ADA2所致

3、。為了進一步弄清結核性胸積液中ADA2來源，ADA2在結核性胸積液和腫瘤性胸積液胸膜病理組織的分布，并了解結核性和腫瘤性胸積液中總ADA、ADAi和ADA2的活性。本研究分別從體內、體外來研究ADA、ADAi和ADA2的分布情況，進行以下實驗研究：1、收集結核性胸積液和腫瘤性胸積液患者的胸積液，檢測胸積液中總ADA、ADA1和ADA2活性，以了解結核性胸積液和腫瘤性胸積液中ADA同功酶的變化情況；2、體外研究用佛波酯(PMA)刺激THP

4、-1細胞，建立單核巨噬細胞模型。然后觀察經卡介苗刺激后各時段單核巨噬細胞培養(yǎng)上清液中總ADA、ADA1和ADA2活性的變化；3、應用CECR1(即ADA2)抗體進行結核性胸積液和腫瘤性胸積液的胸膜組織的ADA2免疫組化檢測，進一步了解ADA2的細胞來源和CECR1抗體在結核病理的應用。通過本研究，將進一步了解結核性胸積液ADA同功酶活性變化情況及其產生原因，尤其是有助于了解ADA2是否來自于單核巨噬細胞。在此基礎上，將有助于加深對單核巨

5、噬細胞抗結核分技桿菌感染機制的認識和拓寬ADA檢測尤其是ADA2檢測的應用。
　　 材料和方法
　　 1.結核性胸積液和腫瘤性胸積液的ADA同功酶活性檢測
　　 收集廣州市胸科醫(yī)院2009年3月至2009年8月確診結核性胸積液患者39例和腫瘤性胸積液患者30例，按照檢測試劑盒的說明并根據是否加入ADA1抑制劑(EHNA)，測定胸積液總ADA活性和ADA2活性，ADA1=總ADA-ADA2，計算ADA2占總ADA的

6、比例。
　　 統(tǒng)計學方法
　　 實驗數(shù)據以x±s表示，如數(shù)據服從正態(tài)分布，用t檢驗。如不服從正態(tài)分布，兩組數(shù)據之間的比較應用Wrilcoxon兩樣本秩和檢驗，以p<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 2.卡介苗對單核巨噬細胞腺苷脫氨酶同功酶活性的影響
　　 用佛波酯刺激THP-1細胞，建立單核巨噬細胞模型。然后測定經空白(0mg/ml)和低濃度(0.033mg/ml)、中濃度(0.05mg/ml)、高濃度

7、(0.1mg/m1)4個卡介苗刺激劑量來刺激的0小時、6小時、12小時、24小時的細胞培養(yǎng)上清液的ADA、ADA1和ADA2活性。
　　 3.結核性胸積液和腫瘤性胸積液病理組織的ADA2免疫組化檢測
　　 選取經病理確診的結核性胸積液和腫瘤性胸積液病理組織，應用CECR1(即ADA2)抗體，用免疫組化方法檢測ADA2在結核性胸積液和腫瘤性胸積液病理組織中的分布。以巨噬細胞表面標志CD68抗體代替ADA2抗體作免疫組化為陽

8、性對照，以PBS代替ADA2抗體作免疫組化為陰性對照。
　　 結果
　　 1.結核性胸積液組ADA活性(44.6±23.7)比惡性胸積液組(15.7±14.4)明顯升高，Wilcoxonw值是643，p<0.01；結核性胸積液組ADA2活性(31.1±17.4)明顯高于惡性胸積液組(10.5±9.2)，Wilcoxonw值是657，p<0.01。結核性胸積液組ADA活性明顯升高主要是由于ADA2活性升高引起，ADA2占總

9、ADA69.5％?？侫DA診斷結核性胸積液的敏感性和特異性分別為79.5％和90.0％。ADA2診斷結核性胸積液的敏感性和特異性分別為79.5％和93.3％。
　　 2.卡介苗作用24小時后，高濃度、中濃度、低濃度卡介苗組的總ADA和ADA2活性和空白對照組相比，均有明顯升高趨勢。高濃度卡介苗組的總ADA與空白對照組相比為3.5/1.3，高濃度卡介苗組的ADA2活性和空白對照組相比為2.5/1.0?？侫DA升高，以ADA2升高為

10、主，ADA2占其組總ADA71.4％。中濃度卡介苗組的總ADA與空白對照組相比為2.8/1.3，中濃度卡介苗組的ADA2活性和空白對照組相比為2.0/1.0?？侫DA升高，以ADA2升高為主，ADA2占其組總ADA71％。低濃度卡介苗組的總ADA與空白對照組相比為2.6/1.3，低濃度卡介苗組的ADA2活性和空白對照組相比為1.8/1.0?？侫DA升高，以ADA2升高為主，ADA2占其組總ADA69％。
　　 3.結核性胸積液病

11、理組織ADA2免疫組化顯示結核結節(jié)的朗罕巨細胞和它周圍的上皮樣細胞被深染，它們的胞漿和胞膜有棕黃色沉著，ADA2免疫組化的細胞染色與以巨噬細胞表面標志CD68抗體的免疫組化相似。小部分淋巴細胞淺染，大部分淋巴細胞不染色。胸膜轉移性腺癌的ADA2免疫組化顯示只見小量吞噬細胞淺染。結核性胸積液和腫瘤性胸積液病理組織ADA2免疫組化陰性對照(PBS代替ADA2抗體)圖片無棕黃色沉著。
　　 結論
　　 1、結核性胸積液總ADA