人胚胎干細胞體內(nèi)分化途徑獲取神經(jīng)干細胞及DNA甲基化酶Dnmt3a和Dnmt3b表達下調對人胚胎干細胞的影響.pdf

1、人類胚胎干細胞（human embryonic stem cells，hESCs）來源于早期胚胎、具有自我更新和分化發(fā)育為三個胚層組織潛能的多能性細胞。hESCs在多個領域，如細胞治療、組織工程、發(fā)育生物學、基因功能研究、藥物篩選等領域展示了巨大的應用前景。 第一章：人胚胎干細胞株HSF6培養(yǎng)。 目的：探索和建立人胚胎干細胞株HSF6的培養(yǎng)方法。 方法：從ICR胎鼠（E13.5）中分離胚胎成纖維細胞（mouse

2、embryonic fibroblast，MEF），檢測絲裂霉素C處理或γ射線照射后MEF的生長狀態(tài)并作為hESCs飼養(yǎng)層；將hESCs培養(yǎng)于含10ng/mL堿性成纖維細胞生長因子的KO-DMEM培養(yǎng)基中，采用hESCs的酶消化法傳代和機械法（巴氏德管制作的傳代工具）傳代；并對培養(yǎng)的HSF6進行堿性磷酸酶染色、表面標記檢測、體外擬胚體（embryoidbody，EB）分化能力檢測等特征鑒定。 結果：第3-5代的MEF經(jīng)10μg/

3、mL絲裂霉素C處理1-3小時或經(jīng)3000Radγ射線照射后能抑制增殖。酶消化法傳代后hESCs克隆大小不均，分化克隆容易殘留和擴增；機械法傳代的hESCs克隆大小較均勻，分化克隆殘留較少或培養(yǎng)中容易被剔除，但機械法傳代過程繁瑣、操作時間較長、工作量大；培養(yǎng)的HSF6能維持未分化狀態(tài)。 結論：①建立了ICR胎鼠（E13.5）MEF的分離和培養(yǎng)方法，10μg/mL絲裂霉素C處理1-3小時，或3000Radγ射線照射后可作為HSF6的

4、飼養(yǎng)層；②酶消化法和機械法均可用于hESCs的傳代。 第二章：hESCs體內(nèi)分化途徑獲取神經(jīng)干細胞。 目的：從hESCs畸胎瘤中分離人神經(jīng)干細胞（neural progenitor cells，NPC）。 方法：將hESCs注射到SCID鼠體內(nèi)分化為畸胎瘤，采用貼壁培養(yǎng)法從中分離人NPC；免疫組織化學法檢測NPC標記-巢蛋白（nestin）；檢測NPC分化能力，對分化細胞檢測神經(jīng)元標記-β微管蛋白Ⅲ（Neuron

5、-specific classⅢ beta-tubulin，TuJⅠ）和膠質細胞標記-膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）。 結果：hESCs注射SCID鼠后5-8周后可分化為畸胎瘤，經(jīng)過貼壁培養(yǎng)和連續(xù)傳代從中分離到NPC，免疫組織化學檢測nestin呈陽性，能分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞，分別表達TuJⅠ和GFAP。 結論：①利用貼壁培養(yǎng)法可從hESCs畸胎瘤中分離

6、到NPC；②“hESCs-SCID鼠-畸胎瘤”模型為細胞組織工程、發(fā)育分化研究提供了一個新的方法。 第三章：Dnmt3a和Dnmt3b表達下調對hESCs的影響。 目的：研究DNA新生甲基化酶Dnmt3a（DNA methyltransferase 3a）和Dnmt3b（DNA methyltransferase 3b）表達下調后對hESCs的影響。 方法：觀察Dnmt3a與Dnmt3b表達下調后hESCs的生長

7、特性；免疫熒光檢測hESCs表面標記；RT-PCR檢測維持胚胎干細胞自我更新和維持未分化的相關基因；檢測hESCs體外EB分化情況，在不同分化時間行AKP染色和RT-PCR檢測三個胚層基因表達情況；檢測hESCs在SCID鼠體內(nèi)分化能力。 結果：Dnmt3a和Dnmt3b表達下調后hESCs：在MEF上呈克隆式生長，表面標記檢測呈hESC特征，表達Oct3/4、Sox2和Nanog；EB分化障礙、AKP消退延遲，Dnmt3b下調