髓系白血病骨髓有核細胞中Wnt5a啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)及其與白血病發(fā)生關(guān)系的研究.pdf

1、目的:
　　 Wnt蛋白家族包括多個成員且序列和信號傳導方式高度保守,在調(diào)控胚胎發(fā)育中起重要作用,Wnt5a是其家族成員之一,該基因在各類腫瘤中的作用是近年關(guān)注的熱點之一。與Wnt5a相關(guān)的研究涉及多種腫瘤,并且在不同腫瘤中的表現(xiàn)不一。髓系白血病在中國的發(fā)病率持續(xù)升高,且國內(nèi)外罕見Wnt5a與髓系白血病關(guān)系的報道,我們前期研究已證明Wnt5a具有抑制白血病細胞株增殖的作用,其表達缺失可能與白血病發(fā)生有關(guān),但明確的作用機制尚未深入

2、研究。本研究擬觀察髓系白血病病人治療緩解前后骨髓有核細胞Wnt5a啟動子甲基化水平的變化和去甲基化藥物對白血病細胞Wnt5a啟動子甲基化水平的影響,進一步探討它表達下調(diào)或沉默的機理以及與髓系白血病發(fā)生的關(guān)系,從而為白血病提供新的腫瘤診斷標志物和基因治療靶點。
　　 方法:
　　 1.MSP法檢測30例急性髓細胞白血病初診病例和31例急性髓細胞白血病緩解病例骨髓有核細胞Wnt5a啟動子甲基化水平。
　　 2.MSP

3、法檢測17例慢性粒細胞白血病慢性期病例標本和3例急變期病例標本W(wǎng)nt5a啟動子甲基化水平。
　　 3.淋巴細胞分離液和細胞培養(yǎng)技術(shù)分離培養(yǎng)髓系白血病原代細胞和骨髓基質(zhì)細胞,并應(yīng)用RT-PCR方法檢測2例培養(yǎng)的白血病原代細胞和骨髓基質(zhì)細胞中Wnt5a的表達。
　　 4.MSP法檢測白血病原代細胞和骨髓基質(zhì)細胞中Wnt5a啟動子甲基化情況。
　　 5.MTT法檢測不同作用時間點和不同濃度去甲基化試劑Adc處理條件下的

4、各組U937細胞的增殖情況,并確定后期實驗的最適藥物用量和作用時間。
　　 6.去甲基化試劑Adc處理U937白血病細胞株,檢測不同藥物濃度作用下Wnt5a的表達水平和Wnt5a基因啟動子甲基化的水平的差異。
　　 7.流式細胞術(shù)檢測去甲基化試劑Adc處理U937細胞2d后細胞周期的變化情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.Wnt5a啟動子甲基化情況:30例急性髓細胞白血病初診病例中22例出現(xiàn)甲基化現(xiàn)象,啟動子

5、甲基化率為73.3％(22/30);31例急性髓細胞白血病緩解病例中3例出現(xiàn)甲基化現(xiàn)象,甲基化率為9.7％(3/31)。
　　 2.17例慢性粒細胞白血病慢性期病例標本和3例急變期病例標本中,Wnt5a啟動子都未見甲基化。
　　 3.分離獲得懸浮生長的白血病原代細胞和貼壁生長的骨髓基質(zhì)細胞中,骨髓基質(zhì)細胞Wnt5a表達陽性,而白血病原代細胞中未檢測到Wnt5a表達。
　　 4.骨髓基質(zhì)細胞中Wnt5a啟動子沒有發(fā)

6、生甲基化,而在白血病原代細胞中分別表現(xiàn)為部分甲基化和完全甲基化兩種情況。
　　 5.不同濃度去甲基化試劑Adc處理U937細胞不同時間,最終確定適用于U937細胞的Adc作用時間為48h,濃度范圍為3μmol/L～10μmol/L。
　　 6.Adc處理后U937細胞Wnt5a啟動子甲基化水平下調(diào),mRNA表達恢復,且在一定濃度范圍內(nèi),Wnt5a的表達量與Adc藥物濃度有關(guān)。
　　 7.與對照組細胞相比,Adc處

7、理后U937細胞G2期增高,表明Adc處理后,細胞周期被阻滯在G2期。
　　 結(jié)論:
　　 1.Wnt5a啟動子甲基化現(xiàn)象在急性髓細胞白血病初診病例中陽性率為73.3％,明顯高于緩解病例陽性率9.7％,證實了我們前期研究發(fā)現(xiàn)白血病標本中普遍存在Wnt5a表達缺失是因其啟動子異常甲基化所致。
　　 2.治療緩解后Wnt5a啟動子甲基化狀態(tài)明顯下降,表明我們前期研究發(fā)現(xiàn)治療緩解病例Wnt5a表達恢復的原因是經(jīng)治療去除

8、了其啟動子的甲基化狀態(tài)。研究結(jié)果提示W(wǎng)nt5a啟動子的異常甲基化可能與白血病細胞的惡性增殖有關(guān),Wnt5a表達水平變化和啟動子甲基化狀態(tài)可能成為判斷病情發(fā)展和預后的實驗室診斷新指標。
　　 3.慢性期和急變期的慢粒病人骨髓有核細胞Wnt5a啟動子均未見甲基化現(xiàn)象。前期研究中Wnt5a在慢粒病人和K562細胞中不表達或低表達,在mRNA水平上與在急性髓系白血病中極為類似;但啟動子甲基化研究提示W(wǎng)nt5a在慢粒病人中表達下調(diào)原因不同

9、于急性髓細胞白血病,可能受其他機制調(diào)節(jié),有待進一步研究。
　　 4.白血病病人的骨髓基質(zhì)細胞中Wnt5a高表達,且啟動子未見甲基化,而白血病腫瘤細胞Wnt5a低表達且啟動子發(fā)生明顯甲基化,說明白血病病人骨髓中的基質(zhì)細胞可能未發(fā)生異常,Wnt5a啟動子甲基化可能特異的出現(xiàn)在白血病細胞等惡性細胞中,是急性髓細胞白血病中Wnt5a低表達的主要原因。
　　 5.去甲基化試劑Adc作用后,白血病細胞U937增殖能力減低,提示W(wǎng)nt

10、5a的表達可能抑制白血病細胞增殖。
　　 6.Adc處理后,Wnt5a表達恢復,U937細胞G2期增高,提示W(wǎng)nt5a可能將細胞周期阻滯在G2期,細胞不能進行有絲分裂,從而抑制了細胞的增殖,但去甲基化試劑不能完全改變U937細胞Wnt5a啟動子異常甲基化情況,說明仍有其他機制維持白血病細胞的異常甲基化,其具體機制仍需進一步研究。
　　 以上研究提示,Wnt5a啟動子甲基化水平在急性髓細胞白血病病例中普遍升高,而在治療緩解