ID4核心啟動(dòng)子區(qū)甲基化在兒童白血病發(fā)病中的作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 研究發(fā)現(xiàn)ID4基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)。目前關(guān)于ID4甲基化研究主要集中在實(shí)體瘤方面，有關(guān)白血病的研究尚少。本文主要探討兒童白血病DNA結(jié)合抑制因子4(inhibitor of DNA binding 4，ID4)基因核心啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)及其與ID4表達(dá)的關(guān)系。
　　 方法：
　　 1.ID4啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)檢測(cè)：
　　 1)采用甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(methyla

2、tion-specific polymerase chain reaction，MS-PCR)對(duì)32例初發(fā)白血病患兒骨髓、34名同期非腫瘤疾病兒童(對(duì)照組)外周血單個(gè)核細(xì)胞及白血病細(xì)胞系Jurkat和Molt4進(jìn)行ID4基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀況分析。
　　 2)DNA重亞硫酸氫鈉處理后ID4基因啟動(dòng)子區(qū)測(cè)序，檢測(cè)CpG位點(diǎn)胞嘧啶甲基化狀況。
　　 2.ID4基因表達(dá)檢測(cè)：
　　 1)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(re

3、verse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)ID4mRNA的表達(dá)。
　　 2)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)ID4蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.ID4基因啟動(dòng)子區(qū)在白血病細(xì)胞系Jurkat和Molt4中均呈完全甲基化狀態(tài)，在初發(fā)白血病患兒中完全甲基化率(24/32，75.0％)顯著高于對(duì)照組患兒(6/34，17.6％)；部分甲基化率(7/32，21

4、.9％)低于對(duì)照組(24/34，70.6％)。二者差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。急性淋巴細(xì)胞白血病組與非淋巴細(xì)胞白血病組的完全甲基化率、部分甲基化率及非甲基化率差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.10)。
　　 2.測(cè)序分析結(jié)果顯示：
　　 1)在完全甲基化狀態(tài)的ID4基因核心啟動(dòng)子區(qū)所有CpG位點(diǎn)均呈甲基化狀態(tài)。
　　 2)完全非甲基化狀態(tài)的ID4基因核心啟動(dòng)子區(qū)所有CpG位點(diǎn)均呈非甲基化狀態(tài)。
　　

5、 3)部分白血病組非甲基化的序列中有少數(shù)CpG位點(diǎn)甲基化出現(xiàn)。
　　 3. ID4的表達(dá)：
　　 1)RT－PCR結(jié)果顯示：Jurkat及Molt4細(xì)胞系及呈完全甲基化狀態(tài)的白血病病例無(wú)ID4-mRNA表達(dá)，而部分甲基化及完全非甲基化的對(duì)照組則有表達(dá)。
　　 2)免疫組化結(jié)果顯示：白血病組ID4蛋白表達(dá)(4/27，14.8[％])低于對(duì)照組(27/28，96.4％)，差異有顯著性意義(P<0.001)。<

6、br>　　 4. 白血病ID4啟動(dòng)子區(qū)甲基化與ID4表達(dá)之間的關(guān)系：ID4核心啟動(dòng)子區(qū)完全甲基化使ID4蛋白表達(dá)缺失。
　　 結(jié)論：
　　 1.白血病細(xì)胞系Jurkat、Molt4細(xì)胞中ID4核心啟動(dòng)子區(qū)呈完全甲基化狀態(tài)，ID4基因失活，ID4mRNA及ID4蛋白表達(dá)受抑。
　　 2.兒童白血病多數(shù)病例中存在ID4核心啟動(dòng)子區(qū)完全甲基化狀態(tài)，甲基化的ID4基因抑制ID4mRNA及ID4蛋白表達(dá)。