核受體共激活因子NCOA5單克隆抗體的制備及其在乳腺癌中的表達(dá)研究.pdf

1、目的:
　　應(yīng)用小鼠雜交瘤技術(shù)制備能夠識(shí)別NCOA5蛋白的單克隆抗體;檢測(cè)乳腺癌標(biāo)本中NCOA5的表達(dá)，并分析NCOA5與相關(guān)臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性;觀察沉默NCOA5對(duì)于乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移的影響。
　　方法:
　　利用PCR技術(shù)體外擴(kuò)增NCOA5羧基C端基因片段，將該片段插入原核表達(dá)載體pET-41a中;使用IPTG誘導(dǎo)NCOA5重組蛋白的表達(dá);采用SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物的可溶性并進(jìn)行規(guī)?；磉_(dá)，采用Ni-NT

2、A柱親和純化NCOA5重組蛋白，采用紫外分光光度計(jì)、SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍(lán)染色分析蛋白濃度和純度;利用小鼠雜交瘤技術(shù)制備抗NCOA5的單克隆抗體，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)、免疫熒光(Immunonousece)和免疫組化(Immunohistochemistry)方法驗(yàn)證單克隆抗體識(shí)別NCOA5的敏感性及特異性;利用PCR技術(shù)分段擴(kuò)增NCOA5 C端基因片段，將其插入pMA

3、L-c2X原核表達(dá)載體并進(jìn)行原核蛋白的表達(dá)，通過(guò)Western Blot初步分析單克隆抗體所識(shí)別表位氨基酸序列;利用所制備的單抗行免疫組化檢測(cè)NCOA5在乳腺癌標(biāo)本中的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)其與相關(guān)臨床病理指標(biāo)的關(guān)系;應(yīng)用慢病毒技術(shù)干擾NCOA5在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中的表達(dá)，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(CCK-8 assay)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖的影響，細(xì)胞劃痕(woundhealing)及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞遷移的影響。
　　結(jié)果

4、:
　　成功構(gòu)建了pET-41a/NCOA5-C-ter重組質(zhì)粒用于原核蛋白的表達(dá)，考馬斯亮藍(lán)染色顯示誘導(dǎo)細(xì)菌裂解后上清蛋白大小約69 kDa，與預(yù)期一致，說(shuō)明成功表達(dá)NCOA5重組蛋白，純化后考馬斯亮藍(lán)染色顯示蛋白純度高、可用于免疫小鼠;雜交瘤細(xì)胞經(jīng)間接ELISA檢測(cè)成功篩選出一株抗體8B11，抗體效價(jià)為1∶32，000。Western Blot、免疫熒光及免疫組化方法提示單克隆抗體8B11能夠特異性識(shí)別細(xì)胞內(nèi)NCOA5，NCO

5、A5定位于細(xì)胞核并在多個(gè)腫瘤細(xì)胞系中存在表達(dá);正確構(gòu)建了pMAL-c2X/NCOA5-C-ter-N'及pMAL-c2X/NCOA5-C-ter-C'重組質(zhì)粒用于分段表達(dá)NCOA5 C端原核蛋白，考馬斯亮藍(lán)染色顯示誘導(dǎo)細(xì)菌裂解后上清蛋白大小與預(yù)期一致，說(shuō)明重組蛋白表達(dá)成功，Western Blot顯示8B11能夠識(shí)別NCOA5蛋白第291-434個(gè)氨基酸組成的蛋白;乳腺癌標(biāo)本的免疫組化結(jié)果顯示，隨著腫瘤的增大，NCOA5表達(dá)的陽(yáng)性表達(dá)率

6、升高(P=0.008);在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，NCOA5表達(dá)的陽(yáng)性表達(dá)率升高（P=0.042）;隨著腫瘤TNM分期的增加，NCOA5的陽(yáng)性表達(dá)率逐漸上升（P=0.028）;NCOA5在ER陰性標(biāo)本中陽(yáng)性表達(dá)率顯著升高(P=0.006); NCOA5在PR陰性標(biāo)本中陽(yáng)性表達(dá)率升高（P=0.025）;NCOA5表達(dá)與年齡、組織學(xué)分級(jí)、HER-2無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。慢病毒感染乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231后，Western Bl

7、ot顯示沉默NCOA5表達(dá)有效，CCK-8法表明沉默NCOA5后細(xì)胞增殖能力下降(P＜0.05)，細(xì)胞劃痕(wound healing)及Transwell實(shí)驗(yàn)表明沉默NCOA5后細(xì)胞遷移能力下降（P＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　(1)利用pET-41a原核表達(dá)載體，成功表達(dá)并純化了NCOA5C端重組蛋白;
　　(2)利用雜交瘤技術(shù)成功制備了一株效價(jià)高、特異性好單克隆抗體8B11，可用于Western Blot、免疫

8、熒光和免疫組化檢測(cè)NCOA5的表達(dá)情況，其抗原表位范圍為NCOA5蛋白第384-434個(gè)氨基酸;
　　(3)NCOA5在肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌細(xì)胞系中均存在表達(dá)，NCOA5在乳腺癌中陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及ER、PR的表達(dá)水平相關(guān)，具有作為腫瘤標(biāo)志物的潛在價(jià)值;
　　(4)沉默乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中NCOA5的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞增殖及遷移能力下降，提示NCOA5能夠通過(guò)ERα以外的途徑影響細(xì)胞的