人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤中MACC1基因的表達(dá)及其RNAi對生物學(xué)特性的影響.pdf

1、人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem,CNS)中最常見的腫瘤類型。其發(fā)病率約占顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的40％，其中有近80％為高度惡性腫瘤。腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤的預(yù)后差，5年存活率為20-30％，高級別惡性膠質(zhì)瘤的平均存活期僅為9-12月。近年來，盡管膠質(zhì)瘤的手術(shù)、放療及化療等技術(shù)有很大提高，但臨床治療效果并未顯著改善。高級別惡性膠質(zhì)瘤治療困難的原因主要是其具有高度惡性生物學(xué)特征，包括：過度增殖、較強的侵襲和遷移能力等。

2、近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，在分子生物水平治療膠質(zhì)細(xì)胞瘤已成為國內(nèi)外學(xué)者研究的重要方向。尋找關(guān)鍵的治療惡性膠質(zhì)瘤的分子靶點，從根本上改變其惡性生物學(xué)特性，對治療這一疾病有著重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價值。
　　肝細(xì)胞生長因子(hepatocytegrowthfactor,HGF)及其酪氨酸激酶受體c-Met是影響腦腫瘤生長和血管發(fā)生的重要分子。HGF和c-Met在腦腫瘤中廣泛表達(dá)，且表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度、血管密度及患者

3、預(yù)后密切相關(guān)。HGF和(或)c-Met在腦腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)會促進腫瘤發(fā)生、生長以及腫瘤相關(guān)的血管生成。相反，在體內(nèi)荷瘤實驗中，通過下調(diào)HGF和c-Met的表達(dá)可以抑制移植腫瘤生長和瘤內(nèi)血管生成。HGF主要由腫瘤細(xì)胞合成并分泌，而其所結(jié)合的受體c-Met則表達(dá)于腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。c-Met激活后不但促進了腫瘤細(xì)胞和腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，還抑制了腫瘤細(xì)胞凋亡。體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中c-Met激活后誘導(dǎo)了胞外基質(zhì)降

4、解、微管形成以及血管發(fā)生。HGF誘導(dǎo)腦腫瘤細(xì)胞血管發(fā)生的方式包括直接作用和間接作用兩種：間接作用為HGF通過調(diào)控某些與血管發(fā)生相關(guān)的蛋白來發(fā)揮作用；目前對于直接作用的分子機制還不明確。鑒于HGF/c-Met信號通路在腦腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用，通過阻斷該通路達(dá)到抑制腦腫瘤生長和血管發(fā)生，已成為近年來人腦膠質(zhì)瘤分子靶向治療的重要研究方向。
　　UlrikeStein等于2009年利用全基因組表達(dá)分析技術(shù)首次在人結(jié)腸癌組織標(biāo)本發(fā)現(xiàn)了結(jié)

5、腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)分子1(metastasis-associatedincoloncancer1,MACC1)。該研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌細(xì)胞中MACC1與c-Met的啟動子結(jié)合，調(diào)節(jié)了c-Met基因的表達(dá)和活化，決定性的影響了c-Met所參與的信號傳遞，最終通過調(diào)控HGF/c-Met信號通路促進細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。隨后多項研究證實，MACC1在肝癌、肺癌、卵巢癌的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中均發(fā)揮重要作用。
　　關(guān)于MACC1與腦膠質(zhì)瘤病理分級

6、的相關(guān)性；其在腦腫瘤組織中的表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)定位情況；對膠質(zhì)瘤的惡性生物學(xué)特性的影響；在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中與HGF的受體c-Met及其所調(diào)控的下游信號分子間的關(guān)系。目前國外尚未有相關(guān)報道，本課題基于以上問題進行了系列研究，結(jié)論如下：
　　1、檢測MACC1基因在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況
　　本研究首先采用RT-PCR和Westernblot方法檢測了四株人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(U251、U87、SHG44、BT325)中MACC1mRNA和

7、蛋白的表達(dá)水平。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MACC1mRNA和蛋白在四株細(xì)胞系中均有表達(dá)，且在U87細(xì)胞中的表達(dá)量相對較高。這提示MACC1在人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞細(xì)胞系中的普遍高表達(dá)可能與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)特性相關(guān)。同時，也為后續(xù)RNAi實驗中細(xì)胞系的選擇提供了依據(jù)。接著利用realtime-PCR和免疫組化染色方法檢測了MACC1mRNA和蛋白在98例不同臨床病理級別的人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤標(biāo)本中的表達(dá)情況。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MACC1分子定位于膠質(zhì)瘤細(xì)胞的

8、胞核與胞漿；MACC1mRNA和蛋白在各病理分級的膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織中廣泛表達(dá)，且表達(dá)量隨病理級別的升高而增高。這提示MACC1在人腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生和惡性演化過程中具有重要功能。最后運用免疫組化染色方法觀察了上述腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織中的c-Met的細(xì)胞定位和表達(dá)情況。結(jié)果顯示，c-Met在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中定位于胞漿和胞膜；表達(dá)量隨病理級別升高而增高，且與MACC1的表達(dá)高度正相關(guān)。這提示，與結(jié)腸癌細(xì)胞中MACC1發(fā)揮作用方式相同，MACC1在膠質(zhì)瘤

9、細(xì)胞中可能是通過調(diào)控c-Met的表達(dá)間接影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲的惡性生物學(xué)行為的。
　　2、構(gòu)建MACC1基因RNAi慢病毒載體及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系
　　本研究以MACC1表達(dá)水平較高的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87為研究對象，設(shè)計合成了特異性RNAi片段，并將其克隆入pLKO.1載體，構(gòu)建了經(jīng)測序正確的MACC1基因RNAi慢病毒載體pLKO.1-MACC1shRNA-1和pLKO.1-MACC1shRNA-2。通過慢病毒包裝

10、，感染目的細(xì)胞，嘌呤霉素篩選，建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系U87-S1（MACC1shRNA-1）、U87-S2（MACC1shRNA-2）和U87-NC（陰性對照組）。經(jīng)RT-PCR與Westernblot驗證U87-S1和U87-S2兩組細(xì)胞的MACC1mRNA和蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)。最終成功獲得了能夠穩(wěn)定下調(diào)MACC1基因表達(dá)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系。這為MACC1基因在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的生物學(xué)功能及分子作用機制的后續(xù)研究奠定了實驗基礎(chǔ)。
　　3

11、、觀察MACC1基因干涉后膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為改變
　　本部分實驗以U87、U87-NC、U87-S1和U87-S2四組細(xì)胞為研究對象。體外實驗中，首先通過MTT實驗繪制細(xì)胞生長曲線，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，平板克隆形成實驗和軟瓊脂集落形成實驗檢測細(xì)胞克隆形成數(shù)量的實驗方法，觀察了MACC1基因?qū)δz質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和周期的影響。結(jié)果顯示，與其它兩組相比，生長明顯減緩增殖數(shù)明顯降低；G1期細(xì)胞明顯增多，S期細(xì)胞顯著減少，出現(xiàn)G0/G1期

12、阻滯；U87-S1和U87-S2組的克隆形成數(shù)量明顯低于對照組。研究表明，MACC1基因表達(dá)下調(diào)后明顯抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。進一步運用細(xì)胞劃痕實驗和Transwell侵襲小室方法研究了MACC1基因?qū)δz質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，U87-S1和U87-S2組細(xì)胞的遷移能力與對照組相比明顯減弱；U87-S1和U87-S2組細(xì)胞穿過基質(zhì)膠的數(shù)量也明顯低于其它兩組。研究證明，MACC1基因RNAi對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力

13、具有明顯的抑制作用。
　　在體內(nèi)研究中，采用裸鼠荷瘤實驗研究了MACC1基因RNAi對膠質(zhì)瘤細(xì)胞體內(nèi)成瘤性、增殖和侵襲能力的影響。將U87、U87-NC、U87-S1和U87-S2各組細(xì)胞分別接種于裸鼠皮下，定期測量腫瘤體積，觀察28天后處死。結(jié)果顯示，U87干涉組細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力和腫瘤生長速度與對照組相比明顯降低；移植瘤體積和重量與對照組相比也明顯減少。裸鼠荷瘤實驗進一步驗證了，MACC1基因表達(dá)下調(diào)后抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的

14、增殖和侵襲能力。
　　4、初步探討MACC1影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機制
　　本實驗以U87、U87-NC、U87-S1和U87-S2為研究對象，利用westernblot方法觀察了c-Met的表達(dá)情況；檢測了與膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲密切相關(guān)的，由MAPK/ERK信號通路主要調(diào)控的幾個下游分子的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，U87細(xì)胞中MACC1基因下調(diào)后，p27表達(dá)量顯著升高；c-Met、cdk2以及MMP2的表達(dá)量明顯減少。這