適量酒精對棕櫚酸引起的胰島β細胞功能損傷的保護作用.pdf

1、流行病學調(diào)查顯示:飲酒和2型糖尿病之間存在著U型關系,也就是說適量飲酒對抵抗2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮有益的作用,而長期大量飲酒則增加2型糖尿病發(fā)病的危險性。同時,高脂飲食導致了游離脂肪酸增加,胰島beta細胞功能下降,對葡萄糖的反應性下降以及細胞攝取葡萄糖減少,從而引起了胰島素分泌障礙和胰島素分泌減少,引發(fā)和推進糖尿病的”脂毒性”。由此可見,無論是過量攝入酒精還是高脂飲食均能損害胰島功能,均是2型糖尿病發(fā)病的常見獨立危險因素。目前,國內(nèi)

2、外的研究也多關注在飲酒或高脂這兩個因素單獨對糖尿病的影響而很少將二者放在一起比較。但是我們的日常生活中,人們在飲酒的同時也攝入了大量脂肪,那么這兩種因素同時存在時又會對2型糖尿病的發(fā)病產(chǎn)生怎樣的影響?我們前期的研究發(fā)現(xiàn)適量飲酒改善高脂誘發(fā)的脂肪胰島素抵抗。由此,我們產(chǎn)生疑問:高脂環(huán)境下,適量酒精對2型糖尿病發(fā)生的中心環(huán)節(jié)--β細胞作用如何?
　　 腺苷酸環(huán)化激酶(AMPK)作為機體的能量檢測器,密切觀察細胞的能量狀態(tài)。現(xiàn)在對于A

3、MPK的作用已經(jīng)基本肯定的是促進外周對葡萄糖的攝取;促進脂肪氧化;抑制肝臟的脂肪酸和膽固醇合成;抑制脂肪細胞的脂肪酸合成和甘油三酯分解。在胰島β細胞,葡萄糖是可以通過氧化代謝直接改變細胞內(nèi)的腺苷酸水平來影響AMPK的活化,表現(xiàn)為高糖抑制AMPK的活性。那么,酒精和/脂肪酸是否通過AMPK影響胰島素的分泌呢?
　　 胰腺十二指腸同源異型盒因子-1(PDX-1)是胰腺發(fā)育和胰島素啟動子的重要的轉(zhuǎn)錄因子,能進入細胞核與胰島素基因相結(jié)合

4、引起胰島素的mRNA轉(zhuǎn)錄,對beta細胞內(nèi)分泌功能起重要調(diào)控作用。而葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2(GLUT2)則隸屬于葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白家族(GLUTs),能催化血中葡萄糖轉(zhuǎn)運,促進葡萄糖進入胰島beta細胞內(nèi),與葡萄糖激酶(GCK)共同形成葡萄糖感受器,調(diào)節(jié)胰島beta細胞的胰島素分泌,主要受PDX-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。PDX-1和GLUT2表達上調(diào)可以促進胰島素釋放和含量。
　　 本實驗旨在觀察酒精,飽和游離脂肪酸(棕櫚酸)以及二者合用時(酒加脂

5、)分別對胰島β細胞(INS-1細胞)功能的影響,從胰島素分泌量,調(diào)節(jié)胰島素基因關鍵分子PDX-1及其下游葡萄糖轉(zhuǎn)運分子GLUT2和能量感受器AMPK蛋白表達這幾個方面評價INS-1細胞的功能。
　　 目的:
　　 1.觀察酒精,棕櫚酸以及二者合用時(酒加脂)對胰島β細胞(INS-1細胞)胰島素釋放功能的影響。
　　 2.觀察酒精,棕櫚酸以及二者合用時(酒加脂)對胰島β細胞(INS-1細胞)中調(diào)節(jié)胰島素基因關鍵分子

6、PDX-1及其下游葡萄糖轉(zhuǎn)運分子GLUT2和能量感受器AMPK蛋白水平的影響。
　　 方法:
　　 1.INS-1細胞在含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素、50μMβ-巰基乙醇、0.133 g/L丙酮酸鈉的RPMI1640培養(yǎng)液在37℃、5％C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。當細胞融合80-90％時用胰酶消化后接種于細胞培養(yǎng)皿(106個/皿)或24孔板(2×105個/孔)中,48h時分組處理。分為六個組:

7、正常對照組,20 mmol/L乙醇(20 mmol/L Etoh)組,100 mmol/L乙醇(100 mmol/L EtOH)組,0.2 mmol/L棕櫚酸(PA)組,PA+20 mmol/L EtOH(PA+20 mmol/L EtOH)組和PA+100 mmol/L EtOH(PA+100 mmol/L EtOH)組,孵育48h用于后續(xù)實驗。
　　 2.胰島素釋放實驗:INS-1細胞種于24孔板中,分組處理后,在葡萄糖濃度

8、為3.3mmol/L、27.8 mmol/L的KRB緩沖液中分別37℃孵育40分鐘,收集上清液,放射免疫方法測定分泌的胰島素水平分別為基礎胰島素分泌(BIS)和葡萄糖刺激的胰島素分泌(GSIS)。
　　 3.PDX-1、GLUT2、AMPK的檢測:在INS-1細胞上Westemblotting檢測PDX-1、GLUT2、AMPK蛋白水平表達。
　　 結(jié)果:
　　 1.不同處理因素對INS-1細胞胰島素分泌的影響<

9、br>　　 與對照組的基礎胰島素量(BIS)相比,除了PA組BIS顯著增加了48％外,其余各組BIS均無明顯差異;與PA組相比,只有100 mmol/L EtOH組BIS顯著降低。與對照組葡萄糖刺激的胰島素釋放量(GSIS)相比,20 mmol/L EtOH(模擬適量飲酒)和PA+20 mmol/L EtOH兩GSIS都沒有明顯變化;100 mmol/L EtOH(模擬大量飲酒)組GSIS減低了43％;PA組和PA+100 mmol/

10、L EtOH組GSIS分別下降了41.5％和48％。與PA組相比,PA+20 mmol/L EtOH組GSIS明顯增加(增加68.2％),而PA+100 mmol/L EtOH組沒有發(fā)現(xiàn)增加胰島素釋放的現(xiàn)象。
　　 相應地,圖1還顯示相對于對照,20 mmol/L EtOH組和PA+20 mmol/L EtOH組的胰島素分泌指數(shù)(ISI)沒有顯著變化,而100 mmol/L EtOH組,PA組和PA+100mmol/L EtOH

11、組的ISI則分別降低了36.3％,47％及41.6％。由此可見與酒精相比,PA對ISI的影響更明顯。相對于PA組,PA+20mmol/L EtOH組的ISI顯著升高了47.1％,而PA+100 mmol/L EtOH組則沒有明顯差異。
　　 2.2不同處理組INS-1細胞PDX-1表達的變化
　　 結(jié)果顯示與胰島素釋放實驗相一致,與對照相比,20 mmol/L EtOH組和PA+20 mmol/L EtOH組無明顯影響;

12、100 mmol/L EtOH組,PA組以及PA+100 mmol/LEtOH組PDX-1水平明顯降低,分別下降了21.5％(*p＜0.05),30％(*p＜0.05)和23％(*p＜0.05)。由此可見,與兩個酒精組相比,棕櫚酸(PA)組對細胞影響更大(其中PA組PDX-1比20 mmol/L EtOH組表達量減低更顯著,*P＜0.05)。而PA+20mmol/L ETOH和PA+100mmol/L ETOH兩個酒加脂組的PDX-1蛋

13、白表達又比棕櫚酸組分別增加28％(*P＜0.05)和8％(*p＞0.05)。(見圖2)
　　 2.3檢測不同處理組INS-1細胞GLUT2表達的變化
　　 為了進一步驗證問題,本實驗同時觀察作為PDX-1的下游因子GLUT2的變化趨勢。圖3顯示,與對照組相比,100 mmol/L EtOH組,PA組和PA+20 mmol/LEtOH組GLUT2水平分別降低了17.6％(*p＜0.05),37.5％(*p＜0.05)以及3

14、0.9％(*p＜0.05)。且從下降幅度來看,與兩個酒精組相比,INS-1細胞對棕櫚酸反應性更敏感。
　　 而與PA組相比時,PA+20mmol/L EtOH組的GLUT2蛋白水平則增加35.4％(*p＜0.05),而0.2PA+lOOmmol/L ETOH組的蛋白表達沒有明顯的升高。
　　 2.4不同處理組INS-1細胞AMPK表達的變化
　　 相對于對照組,100 mmol/L EtOH組,PA組以及PA+1

15、00 mmol/L EtOH組T-AMPK表達分別降低了17.5％,(*p＜0.05),26.7％(*p＜0.05)和20.7％(*p＜0.05),而其余組對T-AMPK沒有顯著影響。且相對于兩個酒精組,PA組的T-AMPK表達更低。相對于PA組,PA+20 mmol/L EtOFI組的T-AMPK的表達明顯改善(*p＜0.05)。
　　 圖4顯示除了PA組AMPK活化(P-AMPK/T-AMPK)相對于對照組顯著降低(下降18

16、％,*p＜0.05)以外,其余各組的AMPK活化均無統(tǒng)計學差異。且當PA和適量酒精(20 mmol/L ETOH)共培養(yǎng)時,改善了由PA引起的AMPK活化降低(*p＜0.05)。而大量酒精(100 mmol/L EtOH)與PA合用時,卻沒有出現(xiàn)明顯的改善現(xiàn)象。
　　 結(jié)論:
　　 1.大量酒精和PA均能抑制高糖刺激的胰島素釋放并且下調(diào)PDX-1和GLUT2的蛋白表達水平;大量酒精下調(diào)T-AMPK的表達但對AMPK活化(