水飛薊素及其組分誘導腫瘤細胞凋亡的研究.pdf

1、本研究為進一步開發(fā)水飛薊素的抗腫瘤活性作用并探討其機理，采用人慢性粒細胞性白細病細胞系K562研究水飛薊素及其所含有的各種主要活性成分對該細胞系增殖及凋亡的影響，其中著重研究了采用HPLC分離到的水飛薊賓的兩種非映異構體水飛薊賓A和水飛薊賓B對該細胞系增殖及凋亡的影響。并在一定程度上闡述上述兩種非對映異構體誘導K562細胞凋亡的作用通路。 采用MTT法、臺盼藍染料排斥法研究水飛薊素及其各種組分對K562細胞增殖的影響，比較組分間

2、的活性差異，篩選出活性較強的單體作進一步的凋亡研究。在研究藥物對細胞凋亡的作用中，采用Hoechst染色觀察凋亡過程中染色體的變化及定量評價凋亡；采用瓊脂糖凝電泳方法檢測DNA片段化，進一步驗證凋亡；采用western-blotting免疫印跡技術及RT-PCR法檢測細胞中凋亡相關調控因子的變化；采用單細胞凝電泳檢查DNA的損傷；并結合流式細胞術檢測胞內ROS和Ca2+的變化，探討其機理，闡述凋亡通路。 結果顯示：水飛薊素及其所

3、含的各種組分均具有抑制K562細胞增殖的作用，并發(fā)現(xiàn)水飛薊賓的兩種非對映異構體均比其未分離前的混合物一水飛薊賓具有更強的抑增殖作用。形態(tài)學觀察及DNA的檢測表明，水飛薊賓A和水飛薊賓B可以誘導K562細胞凋亡，使細胞發(fā)生染色體凝聚、形成DNAladder及凋亡小體等一系列凋亡的典型特征，并且水飛薊賓A和水飛薊賓B比水飛薊賓本身具有更強的凋亡誘導作用。 機理研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊賓的兩種異構體在誘導K562凋亡的過程中，可通過線粒體通路

4、激活Caspase-9和Caspase-3，下調抑凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL上調促凋亡蛋白Bax；細胞中P53蛋白也受到了影響，呈現(xiàn)出劑量依賴性升高的趨勢；單細胞凝膠電泳檢測出隨著藥物作用時間的加長，細胞DNA的損傷程度加大；RT-PCR檢測到水飛薊賓A和水飛薊賓B可以抑制細胞MEK1/2和ERK的表達，并呈劑量依賴性；且二者均顯著增加了JNK1/2的表達；在凋亡過程中，水飛薊賓A能夠誘導產生活性氧自由基(ROS)，升高細胞內Ca

5、2+的濃度，但水飛薊賓B的作用則并不顯著，顯示出二者作用機理的不同；此外，在K562細胞中表達量較高的與細胞凋亡密切相關的c-Abl及Bcr-Abl融合蛋白的表達水平也被藥物降低。 以上研究結果表明：水飛薊素及其組分具有抑制人白血病K562細胞增殖的作用，水飛薊賓A及水飛薊賓B具有誘導K562細胞凋亡的作用，且二者無明顯差別但較水飛薊賓略高，在作用機制上也略有不同。水飛薊賓A及水飛薊賓B可通過線粒體途徑，MEK/ERK途徑和JN