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文檔簡介
1、研究背景:
雌激素及其受體(EstrogenReceptor,ER)信號系統(tǒng)在乳腺的發(fā)育和功能分化,以及疾病過程中有著非常重要的作用。乳腺的良惡性病變?nèi)缛橄倌倚栽錾?、乳腺癌等都與ER信號系統(tǒng)的失調(diào)有關。自上個世紀六十年代ElwoodVJensen首次從理論上證實雌激素受體的存在以來,對于ER的研究一直沒有間斷過。雌激素受體有五個結(jié)構(gòu)域,其激活途徑主要有三種,包括經(jīng)典的配體激活途徑、非經(jīng)典激活途徑及磷酸化激活途徑。ER與雌激素
2、結(jié)合后形成配體-受體復合物,引發(fā)雌激素受體的構(gòu)象改變形成二聚體并向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位,并與靶基因上的作用元件ERE結(jié)合激活其轉(zhuǎn)錄;另外ER還可與AP1、SP1等結(jié)合激活相應的靶基因轉(zhuǎn)錄。除了配體結(jié)合激活途徑外,ER還有多個磷酸化位點。這些位點大多位于AF1區(qū),例如305位絲氨酸的磷酸化可使ER在未與配體結(jié)合狀態(tài)下激活。但目前對于雌激素受體磷酸化位點與乳腺的發(fā)育、癌變等關系研究并不透徹。
基因替代鼠(Knockinmice)是研究基因
3、/蛋白特定位點功能的非常有效的途徑和工具,可以建立人類疾病相關的動物模型,在研究探討疾病的發(fā)病機制、相關基因分析、疾病預防等方面起到重要作用;也可以作為新藥研發(fā)的重要評價體系。因此,基因替代鼠不僅有利于帶動生命科學的前沿發(fā)展,也在醫(yī)學研究中起到先導作用。
王瑞安等人前期發(fā)現(xiàn)ER的305位絲氨酸(ER-S305)是一磷酸化位點。Pak1激酶和PKA激酶均可磷酸化這一位點。該位點的磷酸化可使ER在不與配體結(jié)合的狀態(tài)下激活,因而可能
4、參與乳腺的癌變并與乳腺癌對抗雌激素療法的耐藥性有關。
本實驗擬建立與人ER-S305位點同位的ER-S309A基因突變鼠,觀察該磷酸化位點的消失對乳腺發(fā)育和癌變的影響,闡明ER在體內(nèi)的調(diào)節(jié)機制,并進一步探討該位點做為乳腺癌化學預防、治療潛在靶點的可能性提供相關依據(jù)。
目的
通過建立ERS309A基因替代鼠,研究將該位點的絲氨酸突變?yōu)楸彼崾ミ@一磷酸化位點后小鼠的乳腺發(fā)育情況。通過觀察純合型替代鼠的乳腺發(fā)育
5、情況、動情周期的變化,及給予雌激素后乳腺發(fā)育和動情周期的改變,分析ER-S309位點的磷酸化及能夠磷酸化這一位點的激酶分子在生殖功能和乳腺發(fā)育中的作用。
方法
1.建立ER-S309A基因替代鼠。剪尾提取總DNA,PCR擴增相應基因改變片段經(jīng)基因測序確定替代鼠的建立是否成功。
2.將雜合子小鼠相互交配。用PCR結(jié)合酶切分析鑒定基因型。分析子代小鼠的比例是否符合孟德爾遺傳規(guī)律。并觀察純合型雌性小鼠及雄性小鼠是
6、否具有繁育能力,如能繁育則觀測雌性小鼠的哺育能力。
3.分別測定純合型與野生型雌性小鼠血中雌二醇的濃度。
4.分別取6、9、12周齡的純合型和野生型雌性小鼠的第3、4對乳腺卡紅整裝染色觀察發(fā)育情況、HE染色觀察動情周期的變化。
5.野生型小鼠三周齡時行雙側(cè)卵巢去勢手術(shù)后,分為給予雌激素組和對照組;純合型突變小鼠三周齡開始給予雌激素,分別觀察補充激素組和對照組小鼠第6、9、12周第4對乳腺卡紅染色觀察發(fā)育情況
7、,HE染色觀察動情周期變化。
6.純合型和野生型雌性替代鼠,取其雙側(cè)卵巢、輸卵管HE染色,觀察是否有形態(tài)學改變。
結(jié)果
1.基因測序結(jié)果顯示309位的絲氨酸被丙氨酸所替代,表明我們成功建立了ER-S309A基因替代鼠。
2.純合型雄性小鼠不具有生育能力。雌性純合型小鼠具有生育能力,但每窩的鼠仔數(shù)量較野生型雌性小鼠的每窩鼠仔數(shù)量有明顯減少,表明生殖力降低。
3.純合型雌性小鼠血中雌二醇濃度
8、同野生型雌性小鼠血中雌二醇濃度相比沒有明顯差異。
4.純合型雌性小鼠的乳腺發(fā)育較正常野生型小鼠慢,導管生長緩慢、分支減少,乳腺腺泡數(shù)目減少,終末蕾的數(shù)量和面積減少;純合型小鼠的動情周期紊亂,角化細胞數(shù)量減少。
5.野生型雌性小鼠去勢后給予雌激素組乳腺可以正常生長,動情周期中出現(xiàn)明顯的角化細胞;未給予雌激素的對照組乳腺卡紅染色沒有明顯的導管生成,沒有動情周期出現(xiàn)。純合型雌性小鼠三周開始給予雌激素后導管生長速度加快、分支
9、多,終末蕾的數(shù)量、面積增多;動情周期可見多量角化細胞。
6.純合型雌性小鼠卵巢和輸卵管沒有明顯的形態(tài)學改變。
結(jié)論
1.ERS309A基因替代鼠的建立成功;
2.失去ERS309A磷酸化位點后,雌激素受體功能降低,雄性小鼠喪失生殖功能;雌性小鼠生殖能力降低。
3.純合替代鼠血中雌二醇含量正常。
4.動情周期中S309A替代鼠由于ER功能下降,陰道上皮角化細胞數(shù)量減少,給予雌激素
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