雌激素受體α309位點磷酸化對小鼠附睪管腔微環(huán)境的影響和機(jī)制.pdf

1、目的:精子在附睪中獲得運動和受精能力，其中管腔適宜的微環(huán)境對這一過程至關(guān)重要。雌激素受體α（ERα）主要通過配體非依賴途徑維持附睪管腔微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。ERα敲除鼠表現(xiàn)為雄性不育，附睪管腔pH值升高，附睪尾部精子的數(shù)量和活力降低，輸出小管和附睪管中與微環(huán)境相關(guān)的蛋白表達(dá)水平下降。人乳腺上皮細(xì)胞中，通過配體非依賴途徑，ERα305位絲氨酸發(fā)生磷酸化，進(jìn)而調(diào)節(jié)ERα靶基因的轉(zhuǎn)錄。據(jù)此推測，ERα305位點磷酸化有可能參與維持附睪管腔微環(huán)境的穩(wěn)定

2、。本研究通過構(gòu)建與人ERαS305位點同位的ERαS309敲入小鼠，探討ERα309磷酸化位點對附睪管腔微環(huán)境的影響及作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.基因測序驗證ERαS309A敲入（S309AERKI）小鼠構(gòu)建成功后，通過雜合型雌雄小鼠相互配對進(jìn)行育種繁殖，將產(chǎn)生的子代提取基因組DNA，PCR和酶切鑒定基因型。
　　2.通過雌雄交配實驗觀察雄性S309AERKI小鼠的生殖能力，計算機(jī)輔助分析技術(shù)檢測S309AERKI

3、小鼠附睪尾部精子數(shù)量和活力，揭示ERα309位點對生殖功能的影響。
　　3.利用HE染色技術(shù)檢測S309AERKI小鼠睪丸、輸出小管和附睪形態(tài)變化，精密pH試紙檢測S309AERKI小鼠附睪管腔pH值，放射免疫分析法檢測S309AERKI小鼠血清睪酮含量變化，Western-blot和免疫組化檢測ERα在S309AERKI小鼠睪丸、輸出小管和附睪的表達(dá)，分析ERα309位點引起生殖功能改變的原因。
　　4.通過Western

4、-blot、實時定量PCR和免疫熒光染色檢測附睪管腔微環(huán)境相關(guān)蛋白AQP9、CA12和NHE3在S309AERKI小鼠輸出小管和附睪管的表達(dá)；并構(gòu)建ERα-WT、ERα-S309A（組成性非磷酸化）和ERα-S309E（組成性磷酸化）表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，通過Western-blot檢測ERαS309位點磷酸化對CA12和AQP9的影響，揭示ERα309位點引起生殖功能改變的分子機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1.基因測序結(jié)果

5、顯示，小鼠的ERα309位點由原來的絲氨酸替換為丙氨酸，ERα309A敲入（S309AERKI）小鼠構(gòu)建成功。
　　2. S309AERKI雄性小鼠生育力下降，表現(xiàn)為雌鼠受孕率下降40％，平均每窩產(chǎn)仔數(shù)下降48.7%；附睪尾部精子數(shù)量無明顯變化，但精子各級活力顯著下降。
　　3. S309AERKI雄性小鼠中，睪丸和附睪形態(tài)無改變，但輸出小管管腔變大，管壁變薄；附睪管腔pH值在起始部、頭部和尾部均升高；血清睪酮含量升高；ER

6、α在睪丸、輸出小管和附睪各段的表達(dá)沒有改變。
　　4. S309AERKI小鼠輸出小管中，AQP9表達(dá)降低，CA12和NHE3沒有明顯變化；附睪管中，CA12表達(dá)降低，AQP9和NHE3沒有明顯改變。在轉(zhuǎn)染表達(dá)載體的293T細(xì)胞中，ERα-S309A能減弱CA12和AQP9的表達(dá)，ERα-S309E能增強(qiáng)CA12和AQP9的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1. S309AERKI小鼠雄性生育力降低，附睪精子活力下降，表明ERα

7、309位點的磷酸化影響雄性小鼠生殖功能。
　　2. S309AERKI小鼠中，輸出小管形態(tài)異常，附睪管腔pH值升高，睪丸和附睪形態(tài)無改變，ERα蛋白在輸出小管和附睪管的表達(dá)無變化，血清睪酮含量升高，提示ERα309位點的磷酸化通過調(diào)節(jié)輸出小管液體重吸收功能和維持附睪管腔酸性環(huán)境的穩(wěn)定，影響精子在附睪中的成熟。
　　3. S309AERKI小鼠輸出小管中AQP9表達(dá)降低，附睪管中CA12表達(dá)降低；體外實驗中，ERα-S309A