窒息對新生鼠肺組織RBD-2、SP-A和NF-κB表達的影響.pdf

1、隨著圍生醫(yī)學(xué)的發(fā)展和窒息新法復(fù)蘇技術(shù)的普及，窒息新生兒的存活率較前有了明顯提高，對窒息并發(fā)癥的防治也逐漸成為近年來研究的熱點，如缺氧缺血性腦病、顱內(nèi)出血、腎臟損害等。既往的研究結(jié)果提示新生兒窒息后機體的免疫功能明顯受抑制，窒息新生兒發(fā)生肺炎、敗血癥的幾率也比較高。因而進一步研究窒息對免疫功能的影響，提高窒息新生兒的免疫力，對提高新生兒的存活率和改善新生兒的健康狀況有著重要意義。目前，窒息所致新生兒免疫功能異常的機制尚不完全明確，一些研究

2、結(jié)果表明，窒息可導(dǎo)致細胞免疫、體液免疫和紅細胞免疫功能下降，窒息后神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的異常也可影響機體的免疫功能。既往的研究多集中在特異性免疫方面，對于在新生兒期發(fā)揮主要作用的非特異性免疫則研究較少。在呼吸系統(tǒng)的局部免疫防御方面，β-防御素-2(RBD-2)和肺表面活性物質(zhì)結(jié)合蛋白A(SP-A)具有非常重要的意義，窒息是否對肺臟的局部免疫存在影響，以及影響的作用機制如何，目前關(guān)于此方面的報道還比較少。 本實驗采用常壓低濃度氧通氣建立

3、窒息新生大鼠模型，觀察該模型大鼠肺組織的病理改變及肺組織中RBD-2 mRNA、SP-A mRNA的動態(tài)變化，探討窒息對肺組織免疫防御功能的影響，以及核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)在RBD-2、SP-A基因表達中的作用，旨在為今后外源性補充RBD-2、SP-A或干預(yù)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以調(diào)節(jié)體內(nèi)RBD-2、SP-A含量提供理論依據(jù)和實踐方向。 材料與方法 1．研究對象：健康清潔級1日齡新生SD大鼠96只，雌雄不限，體重(5.5g

4、-7.0g)，隨機分為對照組、窒息組、窒息+PDTC組，每組32只。 2．動物模型：窒息組、窒息+PDTC組新生鼠放入密閉缺氧箱內(nèi)，通入含7％O<,2>、93％N<,2>的混合氣體，鈉石灰吸收二氧化碳，溫度、濕度恒定。通氣2h后，將新生鼠放出，恢復(fù)正常通氣于自然空氣中。對照組、窒息組窒息前1h腹腔內(nèi)注射生理鹽水(20ml/kg)，窒息+PDTC組窒息前1h腹腔內(nèi)注射PDTC(200mg/kg)。 3．標本采集及處理：每組

5、新生鼠分別于復(fù)氧后3h、24h、72h、120h處死，取左肺置于10％福爾馬林中固定，制備石蠟切片；右肺置于液氮中，轉(zhuǎn)運至-80℃冰箱保存待測。 4．實驗方法及檢測指標：石蠟切片HE染色光鏡下觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)變化； SABC法免疫組化檢測肺組織中NF-κBp65的表達；RT-PCR法測定RBD-2 mRNA、SP-AmRNA的表達水平。 結(jié)果 1．窒息對新生鼠一般狀況的影響新生鼠置于缺氧箱內(nèi)后，逐漸出現(xiàn)呼吸加

6、快、皮膚蒼白和不同程度的發(fā)紺，窒息早期新生鼠的自主活動增多，隨窒息時間延長自主活動逐漸減少，個別出現(xiàn)四肢抽動，這些改變出現(xiàn)的時間和表現(xiàn)程度存在個體差異，在恢復(fù)供氧后，上述現(xiàn)象基本緩解，但窒息新生鼠仍表現(xiàn)出活動少、反應(yīng)差、體重增長緩慢等。而對照組則活動好、反應(yīng)靈敏，無以上異常表現(xiàn)。 2．肺組織的病理改變對照組出生后肺泡上皮逐漸發(fā)育成熟，肺間質(zhì)逐漸減少，肺泡逐漸增多，肺泡體積也逐漸增大，而且肺泡大小均勻一致。窒息組3h可見肺間質(zhì)稍腫

7、脹，肺泡內(nèi)有少量散在的紅細胞；24h可見肺間質(zhì)水腫，肺小血管擴張、充血，有的區(qū)域呈片狀出血，肺泡腔內(nèi)炎性細胞滲出等病理變化；72h，120h上述變化逐漸好轉(zhuǎn)，但肺間質(zhì)增厚，肺泡體積較小，肺泡大小不均勻。窒，~,+PDTC處理組較窒息組各時間點的病理變化稍減輕，但仍可見間質(zhì)水腫、炎性細胞浸潤等變化。 3．肺組織NF-κBp65表達水平的動態(tài)變化免疫組化染色顯示NF-κBp65蛋白在對照組新生鼠肺組織呈陰性或弱陽性反應(yīng)，偶見胞核著色。窒息組

8、與對照組相比，多個時間點呈陽性反應(yīng)，陽性反應(yīng)產(chǎn)物不僅分布于陽性細胞的胞漿中，細胞核也呈陽性反應(yīng)，表達分布更廣泛。NF-κBp65蛋白在各時間點的表達水平不同：3h，24h，72h NF-κBp65蛋白表達陽性率為分別為(11.78±3.00)％、(9.83±2.59)％、(8.85±2.80)％，高于對照組的(4.65±2.88)％、(5.70±2.05)％、(5.95±2.12)％，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)，120h NF

9、-κBp65蛋白表達陽性率為(7.70±3.05)％，高于對照組的(6.23±2.57)％，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)，其中3h表達水平最高，其次為24h。窒息+PDTC組在3h，24h NF-κBp65蛋白表達陽性率為(8.20±2.96)％、(6.85±2.25)％，均明顯低于窒息組(p<0.05)，72h，120hNF-κBp65蛋白表達陽性率為(6.68±2.54)％、(6.45±3.12)％，低于窒息組，但差異沒有統(tǒng)

10、計學(xué)意義(p>0.05)，其中3h表達水平最高，其次為24h。 4．肺組織RBD-2 mRNA表達水平的動態(tài)變化窒息組肺組織3h RBD-2 mRNA的表達水平為(1.37±0.26)，高于對照組的(0.72±0.21)(p<0.05)，24h，72 h，120h RBD-2 mRNA的水平逐漸下降，72 h，120h分別為(0.81±0.24)、(0.80±0.31)，均低于對照組相應(yīng)時間點的(1.10±0.35)、(1.12

11、±0.43)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。窒息+PDTC組3h，24h，72h，120h RBD-2 mRNA表達水平分別為(1.08±0.29)、 (0.68±0.19)、(0.52±0.16)、(0.47±0.20)，低于窒息組相應(yīng)時間點，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。在窒息組和窒息+PDTC組，RBD-2 mRNA表達與NF-κBp65之間的相關(guān)系數(shù)r=0.595，具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)。 5．肺組織

12、SP-A mRNA表達水平的動態(tài)變化窒息組3h，24h，72h，120h SP-A mRNA的表達水平分別為(0.62±0.26)、 (0.68±0.17)、(0.82±0.30)、(0.92±0.23)，均低于對照組相應(yīng)時間點的 (0.98±0.38)、(1.04±0.34)、(1.20±0.38)、(1.39±0.38)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。窒息+PDTC組3h，24h，72h，120h SP-A mRNA表達水平為

13、(0.59±0.31)、(0.62±0.41)、(0.81±0.37)、(0.86±0.46)均低于窒息組，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。在窒息組和窒息+PDTC組，SP-A mRNA、NF-κBp65之間的相關(guān)系數(shù)為r=0.252，具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。 結(jié)論： 1．本實驗建立的新生鼠窒息模型是成功的，窒息可造成新生鼠肺組織的病理損傷，抗氧化劑PDTC可以減輕窒息引起的肺組織病理損傷； 2．窒

14、息可引起新生鼠肺組織NF-κB活化，隨復(fù)氧時間延長，NF-κB活化逐漸減弱，PDTC可以明顯抑制窒息引起的NF-κB的活化； 3．窒息新生鼠肺組織中的RBD-2 mRNA在窒息后早期較對照組表達增加，隨復(fù)氧時間延長，RBD-2 mRNA的表達逐漸減少，并低于對照組，提示窒息可引起肺組織免疫防御功能下降；RBD-2 mRNA表達量與NF-κBp65蛋白量有強相關(guān)性，提示NF-κB介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄可能是RBD-2 mRNA表達的調(diào)控機制；