蛻皮甾酮對急性肺損傷大鼠肺組織中TNF-αmRAN及SP-A表達(dá)的影響.pdf

1、背景：急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是指機(jī)體遭受嚴(yán)重創(chuàng)傷、休克、嚴(yán)重感染等打擊后，出現(xiàn)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞廣泛損傷為病理特征的一種失控炎癥反應(yīng);是急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的早期階段，臨床上表現(xiàn)為進(jìn)行性肺部彌漫性滲出致呼吸困難及難以糾正的低氧血癥。目前ALI/ARDS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚未完全闡明，但經(jīng)過大量基礎(chǔ)研究表明氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎性反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂等改變均參與疾病發(fā)展，其中炎癥與抗炎癥反應(yīng)之

2、間平衡與失衡在發(fā)病過程中起重要作用。目前，普遍認(rèn)為ALI發(fā)病機(jī)制是在致病因子作用下激活中性粒細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞，并釋放大量炎性介質(zhì)造成機(jī)體的損傷，同時(shí)這些炎性因子能作用其他炎性細(xì)胞來釋放更多的炎性介質(zhì)或細(xì)胞因子，使機(jī)體損害信號進(jìn)一步放大，形成炎癥瀑布效應(yīng)，引起的過度或失控性的全身性炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)。在臨床上，急性肺損傷的主要原因是細(xì)菌感染后釋放內(nèi)毒

3、素引起的，致病主要成分是細(xì)菌細(xì)胞壁外膜中的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)。LPS與相應(yīng)受體結(jié)合后，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，促進(jìn)各種炎性細(xì)胞因子TNF-α等釋放。這些炎性細(xì)胞和炎癥介質(zhì)相互作用，造成肺泡細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞損傷，血管通透性增加，導(dǎo)致肺水腫，引起肺表面活性物質(zhì)分泌減少，肺泡上皮屏障破壞。所以，本實(shí)驗(yàn)通過大鼠腹腔注射LPS復(fù)制ALI模型，并給予特定藥物治療，來觀察炎性介質(zhì)及抗炎物質(zhì)水平的動(dòng)態(tài)變化。腫瘤壞死因子

4、α(Tumor Necrosis Factorα，TNF-α)在炎癥中是一具始動(dòng)和關(guān)鍵性作用的促炎免疫分子，主要由激活的中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞分泌，是具有多種功能的多肽。目前已知TNF-α與相應(yīng)受體結(jié)合后，刺激炎性細(xì)胞粘附并釋放氧自由基等大量炎性介質(zhì)來發(fā)揮細(xì)胞毒性作用;刺激單核巨噬細(xì)胞增加IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等炎性因子的產(chǎn)生，進(jìn)一步加重組織損傷。因此，TNF-α是觀察ALI程度較好指標(biāo)。表面活性蛋白

5、(Surfactant Protein，SP)是主要由肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞和細(xì)支氣管非纖毛上皮細(xì)胞分泌的一類特異性脂蛋白復(fù)合物。SP含量中最豐富且生物活性最強(qiáng)的蛋白是肺表面活性蛋白A（Surfactant ProtemA，SP-A）。研究表明，它能維持肺泡的正常結(jié)構(gòu)和功能;調(diào)節(jié)肺內(nèi)免疫和炎癥反應(yīng);參與調(diào)節(jié)肺表面活性物質(zhì)的合成、代謝;通過特異性與微生物和微粒子結(jié)合，增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬和殺菌能力，并抑制多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的合成與釋放。目前認(rèn)

6、為，SP-A在ALI患者中存在內(nèi)源性代謝異常而減少，加重急性肺損傷。迄今，ALI/ARDS的藥物治療已成為臨床研究的一個(gè)熱點(diǎn)，但仍未找到切實(shí)可靠的治療性藥物，所以尋找其保護(hù)性藥物十分必要。蛻皮甾酮(Ecdysterone，EDS)是一種廣泛存在自然界的甾體化合物，屬于昆蟲生長代謝調(diào)節(jié)激素，最早為昆蟲學(xué)家研究?，F(xiàn)發(fā)現(xiàn)EDS在植物界也廣泛存在且同樣在高等動(dòng)物表現(xiàn)出較強(qiáng)的生理活性:能促進(jìn)核酸及蛋白質(zhì)的合成、抗氧化、促進(jìn)缺血區(qū)血管的生成和側(cè)支循

7、環(huán)的建立，還能有效促進(jìn)傷口愈合等。近年來研究表明EDS還能改善肺組織水腫、降低肺血管通透性等作用，提示對ALI可能具有一定治療作用。為了進(jìn)一步探討EDS對ALI治療作用機(jī)理，我們通過脂多糖誘導(dǎo)ALI大鼠模型，觀察EDS對ALI大鼠的肺組織中炎性介質(zhì)TNF-α及SP-A的水平變化，以闡明EDS對ALI的治療作用效果及可能的機(jī)制。
　　 目的：觀察不同劑量EDS對ALI大鼠肺組織中TNF-α mRNA及SP-A的表達(dá)的影響及其相關(guān)性

8、;探討蛻皮甾酮(EDS)對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷(ALI)的保護(hù)機(jī)理。
　　 方法：⑴實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制作與分組方法:通過Wister大鼠腹腔注射LPS建立急性肺損傷模型。120只健康SPF級成年雄性Wister大鼠，體重170-220克，隨機(jī)分為模型組(24只，L組)、空白對照組(24只，N組)、治療組（即不同劑量蛻皮甾酮組，T組）[分3個(gè)亞組:LPS+EDS20mg/kg組(T1組，24只)、LPS+EDS30mg/

9、kg組(T2組，24只)、LPS+EDS40mg/kg組(T3組，24只)]，各組根據(jù)注射脂多糖后觀察時(shí)間不同再分為2h、4h、24h共3個(gè)亞組，每組8只。模型組和治療大鼠均經(jīng)腹腔注射脂多糖8 mg/kg復(fù)制急性肺損傷模型，對照組腹腔注射等體積生理鹽水。蛻皮甾酮不同劑量治療組在建模1h后給予相應(yīng)劑量的蛻皮甾酮溶液尾靜脈注射;對照組及模型組給予相應(yīng)等體積生理鹽水。⑵標(biāo)本采集檢測方法:分別于相應(yīng)時(shí)間用3％戊巴比妥鈉(30m/kg)腹腔麻醉各

10、組后，腹主動(dòng)脈放血處死動(dòng)物?？焖偌糸_胸腔，取出雙側(cè)肺臟。取各組大鼠右肺下葉HE染色觀察病理改變，并根據(jù)病理學(xué)改變進(jìn)行相應(yīng)評分;取右上肺葉，計(jì)算各組肺濕重與肺干重比值（W/D）;并使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR即(Real-timePCR，RT-PCR)法檢測左肺組織勻漿TNF-α mRNA的表達(dá);使用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)測定左肺組織勻漿中TNF-α;采用Western Blot方法檢測SP-A的表達(dá)水平。
　　 結(jié)

11、果：①一般狀態(tài)觀察:N組的大鼠呼吸平穩(wěn)，未見紫紺，活動(dòng)基本正常，反應(yīng)靈敏;L組的大鼠在注射LPS后呼吸明顯加快，活動(dòng)不活躍，抓取時(shí)無力逃避，以4h最為明顯并伴有紫紺;T組的大鼠呼吸急促程度較LPS組有所減輕，個(gè)別大鼠出現(xiàn)輕微紫紺，但較LPS組活潑，抓取時(shí)能夠逃避。其中2h時(shí)，T組的狀況相似，但在4h、24h時(shí)T3組較T1、T2組大鼠的狀況較好。②光鏡下觀察:200倍光鏡下觀察大鼠右下肺組織HE染色結(jié)果顯示:N組大鼠肺組織的結(jié)構(gòu)物完整，肺

12、泡間隔無水腫，肺泡腔清晰，肺泡間質(zhì)無炎性細(xì)胞浸潤;L組肺泡壁破壞，腔內(nèi)出血，肺間質(zhì)充血水腫，有大量炎性細(xì)胞浸潤;提示肺損傷模型成功。不同劑量T組的肺組織中相對于L組上述改變均有所減輕，程度隨劑量增加而減輕。肺損傷的病理學(xué)評分依據(jù)肺泡和間質(zhì)炎癥及出血、肺水腫、肺不張和透明膜形成;經(jīng)評分后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組間病理改變程度為L＞T1＞T2＞T3＞N;時(shí)間趨勢為:各組肺損傷程度評分在時(shí)間上以4h為重，24h次之，2h較輕。③肺干重/濕重(W/

13、D):與N組相比，L組及T組在2h，4h，24h各時(shí)間點(diǎn)W/D顯著升高(P＜0.05)，其中4h為高峰，24h次之，2h最低。與L組相比，T組各亞組在4h，24h時(shí)間點(diǎn)W/D均顯著降低(P＜0.05)，但在2h里，L組與T1、T2差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而T3明顯降低(P＜0.05)。同一組內(nèi)在不同時(shí)間上W/D的趨勢為:4h＞24h＞2h。④肺組織中TNF-僅含量:N組TNF-α在各時(shí)相點(diǎn)表達(dá)均非常微弱，且相互之間無明顯差別。

14、其余各組與N組相比，表達(dá)均明顯增強(qiáng)(P＜0.05)。與LPS組比較，T組各亞組間在2h、4h、24h均可顯著降低肺組織TNF-α的含量(P＜0.05)。亞組之間比較:T3組在4h、24h時(shí)間點(diǎn)TNF-α的表達(dá)呈現(xiàn)T3＜T2、T1(P＜0.05)，但在2h時(shí)與T2無明顯差異;T2在2h、4h時(shí)間點(diǎn)TNF-α的表達(dá)顯著低于T1(P＜0.05)，兩者在24 h無明顯差異。在時(shí)間表達(dá)上，L組及各T亞組的組內(nèi)在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的肺組織TNF-α的含量兩

15、兩相比均有顯著差異(P＜0.05)，呈現(xiàn)4h＞2h＞24h(P＜0.05)。⑤肺組織中TNF-α mRNA含量:實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示:N組TNF-α mRNA在各時(shí)相點(diǎn)的表達(dá)均非常微弱，且相互之間無明顯差別。其余各組與N組相比，表達(dá)均明顯增強(qiáng)(P＜0.05)。與LPS組比較，T組在不同時(shí)間點(diǎn)均可顯著降低肺組織TNF-α mRNA的表達(dá)(P＜0.05)。T組亞組之間在2h、4h、24 h時(shí)間點(diǎn)TNF-α mRNA的表達(dá)均呈

16、現(xiàn)T3＜T2＜T1(P＜0.05)。時(shí)間表達(dá)趨勢為4小時(shí)最高，2小時(shí)次之，24小時(shí)最低，即4h＞2h＞24h(P＜0.05)。⑥肺組織中SP-A含量:在2h、4h、24h里，N組大鼠肺組織中SP-A表達(dá)無明顯差異，但均明顯高于比T組和L組(P＜0.05);T組各亞組之間在不同時(shí)間點(diǎn)的SP-A表達(dá)都高于L組，且有顯著性差異(P＜0.05);T組亞組之間在24h時(shí)間點(diǎn)的肺組織SP-A表達(dá)隨劑量增加而逐漸上升，即T3＞T2＞T1(P＜0.05

17、)，在2h時(shí)，呈現(xiàn)T3＞T2、T1(P＜0.05)，但T2、T1在此時(shí)間點(diǎn)相比無顯著差異(P＞0.05)。在4h時(shí)，呈現(xiàn)T3、T2＞T1(P＜0.05)，但T2、T3在此時(shí)間點(diǎn)相比無顯著差異(P＞0.05)。時(shí)間表達(dá)趨勢為4小時(shí)最低，24小時(shí)次之，2小時(shí)最高(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：⑴通過腹腔注射LPS可以成功復(fù)制ALI大鼠模型。⑵LPS注射后導(dǎo)致大鼠肺組織水腫;光鏡下肺損傷嚴(yán)重;促炎細(xì)胞因子TNF-α mRNA表達(dá)增強(qiáng);