手足口病相關(guān)病毒VP1蛋白及其菌蛻嵌合抗原免疫效應(yīng)研究.pdf

1、手足口病(Hand-food-and-mouthdisease)是由腸道病毒引起的全球性傳染病,在世界各地均有不同規(guī)模的爆發(fā)流行,我國自1981年在上海始見本病,以后北京、河北、天津、福建、吉林、山東、湖北、安徽、湖北、廣東等十幾個(gè)省市均有報(bào)道。手足口病多發(fā)生于5歲以下兒童,報(bào)告的病例以嬰幼兒為主,可引起手、足、口腔等部位的皰疹,少數(shù)患兒可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜炎等并發(fā)癥,個(gè)別重癥患兒甚至死亡,已成為世界性的公共衛(wèi)生問題,引起了

2、廣泛重視。為加強(qiáng)手足口病防治工作,我國衛(wèi)生部將手足口病列入傳染病防治法規(guī)定的丙類傳染病進(jìn)行管理。目前,在全世界范圍內(nèi)還缺乏有效地抗病毒藥物,研制有效的疫苗是控制手足口病感染流行的最有效策略。本論文針對(duì)手足口病的兩種相關(guān)病毒,設(shè)計(jì)并測(cè)試了以病毒包膜蛋白為基礎(chǔ)的候選疫苗分子,為手足口病的有效預(yù)防奠定研究基礎(chǔ)。
　　一、VP1抗原的免疫效應(yīng)及交叉保護(hù)作用
　　引起手足口病的主要病毒包括腸道病毒71型和柯薩奇病毒組。有研究表明VP1

3、蛋白作為病毒的主要抗原,在小鼠模型上針對(duì)病毒感染可提供一定的保護(hù)效果。本研究中我們應(yīng)用原核表達(dá)系統(tǒng)分別重組制備了腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇B3病毒(CB3)的VP1蛋白。以EV71抗原VP1(EVP1)、CB3抗原VP1(CVP1)為單一或混合免疫原分別對(duì)成年BALB/C小鼠進(jìn)行免疫,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了較高的特異抗體效價(jià),表明VP1蛋白具有良好的免疫原性;免疫血清的病毒中和活性測(cè)試顯示EVP1免疫組血清對(duì)EV71病毒的中和效價(jià)為1:

4、832,CVP1免疫組血清對(duì)CB3病毒的中和效價(jià)為1:1024;在對(duì)其子代新生乳鼠的攻毒試驗(yàn)中,兩種VP1抗原均可對(duì)特異病毒提供較好的保護(hù)效果,EVP1免疫組對(duì)160LD50的EV71病毒攻毒可提供完全保護(hù),CVP1免疫組對(duì)150LD50的CB3病毒攻毒保護(hù)率達(dá)88.9％;提高攻毒劑量EVP1抗原免疫組針對(duì)200LD50的EV71病毒攻毒保護(hù)存活率達(dá)70%,CVP1抗原免疫組對(duì)180LD50的CB3病毒攻毒保護(hù)存活率達(dá)75%。進(jìn)一步的病

5、理分析結(jié)果顯示,相對(duì)于攻毒組嚴(yán)重的肺組織損傷,心肌炎,腸道等病理損傷,免疫保護(hù)組小鼠各器官病理損傷減輕或者消失。在兩種抗原的交叉保護(hù)試驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)EVP1免疫組對(duì)150LD50的CB3病毒保護(hù)效果達(dá)60%,而CVP1免疫組對(duì)高劑量的EV71病毒沒有保護(hù)效果,對(duì)低劑量的EV71病毒(15LD50)攻擊的保護(hù)效果僅有27.3%。
　　此外,我們還成功構(gòu)建了包含EVP1與CVP1分子結(jié)構(gòu)的融合蛋白ECVP1。經(jīng)原核表達(dá)和親和層析純化獲得目

6、的蛋白,并初步驗(yàn)證其免疫反應(yīng)性,ECVP1可同時(shí)被針對(duì)兩種病毒的特異抗血清識(shí)別。
　　二、VP1抗原嵌合菌蛻構(gòu)建及免疫效應(yīng)研究
　　本研究利用實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的革蘭氏陰性菌通用型夾心外膜展示載體pSOMPA,成功將EVP1或CVP1分子在O157:H7菌蛻外膜上錨定表達(dá)。在新構(gòu)建的嵌合菌蛻(EBGs,CBGs)結(jié)構(gòu)中,將原有的O157:H7細(xì)菌膜表面抗原與新的EV71保護(hù)性抗原EVP1或CB3保護(hù)性抗原CVP1共同表達(dá)于菌蛻外膜。

7、兩種嵌合菌蛻免疫小鼠后除了誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生抗O157:H7菌蛻特異抗體(抗intimin特異抗體)外,還誘導(dǎo)產(chǎn)生了抗VP1抗原的特異抗體。與陰性對(duì)照相比,嵌合菌蛻(EBGs或CBGs)不但可以保護(hù)小鼠抵抗20MLD的E.coliO157:H7活菌的灌胃攻擊(70%或75%),同時(shí)免疫所產(chǎn)子代小鼠對(duì)致死劑量(2LD50)的同種病毒EV71或CB3的攻毒有免疫保護(hù)能力,EBGs免疫組可提供100%的完全保護(hù),CBGs免疫組保護(hù)率達(dá)到87.5