濟南市手足口病患者腸道病毒71型的分離鑒定與VP1蛋白的原核表達.pdf

1、目的:
　　 1.從2008年7月至2009年3月濟南市手足口病患者的臨床糞便標本中分離得到病原體并對其進行鑒定。
　　 2.對所分離到的EV71分離株的5’UTR區(qū)基因序列,VP4蛋白基因編碼序列和VP1蛋白基因編碼序列進行序列測定,對所獲得的核酸序列所進行比對,分析其基因特征并進行基因分型。
　　 3.為了提供疫苗研究和免疫學檢測試劑的研發(fā)基礎,對EV71的VP1進行原核表達并對其進行初步鑒定。
　　

2、 方法:
　　 1.EY71的分離和鑒定:標本的采集和處理均按照中國疾控中心的《手足口病標本采集及檢測技術(shù)方案》進行操作,使用三種細胞系MA104、Vero和RD對標本中的病毒進行分離。分離獲得的病毒毒株使用RT-PCR法進行分子生物學鑒定,鑒定時使用腸道病毒通用引物、腸道病毒71型特異性引物和柯薩奇病毒A16型特異性引物進行鑒定。
　　 2.EVT1的基因分型和基因特征分析:使用引物EVP1S和EVP1A對VP1編碼基

3、因進行RT-PCR擴增,使用引物EVG1S和EVG1A對5’UTR區(qū)和VP4編碼基因進行RT-PCR擴增,將擴增后獲得的DNA克隆至PMD-18T載體上后進行測序。所獲得的基因序列使用Bioedit和MEGA4軟件進行分析并構(gòu)建進化樹。
　　 3.重組EV71 VP1蛋白的原核表達:使用引物EVPLA和EVPLS對VP1編碼基因進行擴增并構(gòu)建重組載體PET-30a-VP1,將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌Transetta后獲得工程菌。使用IP

4、TG對工程菌進行誘導獲取基因工程蛋白,使用Western-Blot法和抗His標簽單克隆對工程蛋白進行初步鑒定。
　　 結(jié)果:
　　 1.EV71的分離與鑒定:共從13例糞便標本中使用細胞分離共獲得了7株病毒,經(jīng)RT-PER鑒定后,其中6株為腸道病毒71型,1株為柯薩奇病毒A16型。
　　 2.EV71的基因分型和核酸序列分析:獲得了6株EV71分離株的VP1編碼基因序列和2株EV71分離株的5’UTR及VP4編

5、碼基因序列,序列分析結(jié)果表明所分離得到的6株病毒與中國大陸流行的大部分EV71病毒相對應的核酸序列具有極高的同源性,在進化樹上,與大部分中國大陸地區(qū)的EV71分離株均位于同一大的分支上,屬于C4亞型,但與早期的EV71 C4亞型分離株位于不同的小進化分支上。
　　 3.重組EV71 VP1蛋白的原核表達:經(jīng)IPTG誘導后,在含有重組載體的大腸桿菌中表達了工程蛋白,并使用抗6×His抗體對該蛋白進行了鑒定,鑒定結(jié)果呈陽性。