自噬對(duì)慢性髓細(xì)胞性白血病中IFN1@抗腫瘤活性的影響.pdf

1、IFN1@（I型干擾素簇，也稱IFNα）作為慢性髓細(xì)胞性白血病(CML)的治療藥物，臨床上使得接近80％的早期慢性病人達(dá)到血液學(xué)緩解。但由于白血病治療中IFN1@耐藥的出現(xiàn)，常常影響白血病治療效果及預(yù)后。因此詳細(xì)了解IFN1@耐藥如何發(fā)生將有助于改善慢性髓細(xì)胞白血病治療方案以提升患者的療效及改善預(yù)后。我們前期研究發(fā)現(xiàn)抑制自噬能增強(qiáng)CML細(xì)胞包括干細(xì)胞中伊馬替尼誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用，表明白噬在CML的發(fā)生和治療中發(fā)揮重要作用。然而自噬是否及

2、如何調(diào)控CML細(xì)胞對(duì)IFN1@治療的敏感性目前尚不清楚。
　　本課題首先研究了IFN1@對(duì)CML細(xì)胞自噬的影響。以IFN1@處理K562細(xì)胞和原代CML細(xì)胞后，Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IFN1@以時(shí)間依賴方式增加細(xì)胞微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein1 light chain3，LC3)-Ⅱ的表達(dá);透射電鏡也發(fā)現(xiàn)IFN1@處理后K562細(xì)胞中自噬泡（自噬小體/自噬溶酶

3、體）明顯增加;而免疫熒光及組織蛋白酶B活性分析分別證實(shí)IFN1@處理后LC3陽(yáng)性囊泡(LC3 puncta)的表達(dá)及溶酶體酶活性均明顯增加。這些結(jié)果表明CML細(xì)胞中IFN1@具有自噬誘導(dǎo)劑的作用。
　　其次，我們研究了參與IFN1@誘導(dǎo)自噬的信號(hào)通路。通過基因轉(zhuǎn)染、shRNA抑制關(guān)鍵自噬相關(guān)基因(autophagy associated gene，ATG)表達(dá)，Western blotting、免疫熒光檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制BECN1、

4、ATG5、ATG7能明顯減少IFN1@誘導(dǎo)的LC3-Ⅱ表達(dá)和LC3 puncta的形成，而抑制ULK1不能發(fā)揮相關(guān)作用，表明BECN1、ATG5-ATG7自噬因子參與了IFN1@誘導(dǎo)的CML細(xì)胞自噬的發(fā)生。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，抑制JAK能減少STAT1磷酸化，減低STAT1的轉(zhuǎn)錄活性和LC3 puncta的形成;而抑制STAT1同樣能減少IFN1@誘導(dǎo)的LC3-Ⅱ表達(dá)以及LC3 puncta的聚集。通過Western blotting及免疫

5、共沉淀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)RELA（也稱NFκB P65）shRNA能明顯減少IFN1@誘導(dǎo)的BECN1蛋白及mRNA表達(dá)以及BECN1與PtdIns3K的結(jié)合;而STAT1 shRNA除影響B(tài)ECN1與PtdIns3K結(jié)合外還影響了NFκB活化，表明活化的JAK1-STAT1-NFκB信號(hào)通路參與了IFN1@誘導(dǎo)的BECN1表達(dá)及BECN1與PtdIns3K的結(jié)合。
　　最后我們研究了抑制自噬對(duì)IFN1@誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響。通過流式細(xì)胞

6、術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平并以Western blotting檢測(cè)凋亡效應(yīng)因子CASP3活性，發(fā)現(xiàn)抑制自噬信號(hào)通路中關(guān)鍵因子ATG5、BECN1、ATG7和STAT1均可促進(jìn)IFN1@誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡及CASP3活性增加，而這種作用在HL-60人急性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞株、Jurkat人T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株中同樣存在。小分子自噬抑制劑氯喹能以劑量依賴方式增加IFN1@誘導(dǎo)的凋亡及CASP8活性，表明自噬在調(diào)控IFN1@誘導(dǎo)的凋亡中發(fā)揮

7、重要作用。利用氯喹或shRNA抑制自噬可以上調(diào)CASP8及其剪切片段的表達(dá)，并上調(diào)Bid剪切片段及增加CASP9活性，表明通過藥物以及基因抑制自噬能通過活化CASP8-Bid信號(hào)通路增強(qiáng)IFN1@誘導(dǎo)的凋亡。
　　綜上所述，通過RNAi或氯喹抑制自噬增加了IFN1@在白血病中的抗腫瘤活性，CASP8依賴的凋亡信號(hào)通路可能是其中主要的作用機(jī)制。本研究通過證實(shí)自噬在白血病IFN1@耐藥中的作用及其機(jī)制，提出聯(lián)合自噬抑制劑可能減少IFN