豬腦心肌炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3AB和3ABC基因的表達(dá)與3AB單克隆抗體的制備.pdf

1、腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus，EMCV)是一種重要的人畜共患病病原。EMCV感染最廣泛和最嚴(yán)重的動(dòng)物是豬，感染后仔豬可造成急性心肌炎等實(shí)質(zhì)器官的廣泛病理損傷甚至發(fā)生急性死亡；感染母豬可導(dǎo)致懷孕母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎、木乃伊胎等繁殖障礙。目前國(guó)內(nèi)外該病的病原學(xué)診斷和血清學(xué)檢測(cè)方法都是針對(duì)全病毒或結(jié)構(gòu)蛋白，尚無針對(duì)非結(jié)構(gòu)蛋白方面的檢測(cè)方法的研究。EMCV預(yù)防臨床最常用還是滅活苗，建立檢測(cè)非結(jié)構(gòu)蛋白的抗體

2、的方法，可用于區(qū)別疫苗免疫和自然感染。EMCV和口蹄疫病毒(FMDV)同屬微RNA病毒科，其基因結(jié)構(gòu)類似。許多研究證明FMDV3AB和3ABC ELISA方法能有效檢測(cè)FMDV自然感染水平，但在EMCV研究方面尚無類似的報(bào)道。本研究通過原核和真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)EMCV非結(jié)構(gòu)蛋白3AB和3ABC，并制備3AB的單克隆抗體，主要內(nèi)容包括： 1.EMCV3AB和3ABC基因原核表達(dá)與抗體制備：首先通過PCR方法從重組質(zhì)粒pUC18-EM

3、CV中分別擴(kuò)增得到含完整閱讀框的3AB和3ABC基因，克隆至原核高效表達(dá)載體pGEX-6p-1中，在E.coli BL21(DE3)細(xì)菌中分別成功表達(dá)了重組蛋白GST-3AB和GST-3ABC，大小分別為39kDa和62kDa。由于EMCV3C蛋白為蛋白質(zhì)水解酶，易從3ABC上解離下來，故部分GST-3ABC蛋白降解為GST-3AB和3C(22kDa)。取包涵體純化的GST-3AB蛋白免疫清潔級(jí)小鼠，制備得到3AB蛋白的多克隆抗體。We

4、stern bolt結(jié)果顯示，該抗體可與重組3AB和3ABC蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。 2.桿狀病毒表達(dá)EMCV3AB和3ABC基因：先將目的基因分別克隆至桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體pFastBacTM中，提取陽性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH10 Bac感受態(tài)細(xì)菌，通過藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定，將陽性重組桿狀病毒穿梭載體經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞獲得重組桿狀病毒，并經(jīng)IFA和Western blot鑒定，試驗(yàn)結(jié)果顯示兩個(gè)目的蛋白在昆蟲細(xì)胞中獲得成功表達(dá)，重

5、組3AB分子量約16kDa，重組3ABC蛋白仍然解離成3AB和3C。 3.EMCV3AB單克隆抗體制備：用純化的GST-3AB蛋白免疫BALB/c小鼠并通過雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備其單克隆抗體，經(jīng)間接ELISA篩選陽性的雜交瘤細(xì)胞，獲得1株能穩(wěn)定分泌抗3AB蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株，將其命名為2D12，其亞類測(cè)定為IgG1/κ。Weatern Blot和間接免疫熒光試驗(yàn)證明該單抗能特異性識(shí)別3AB蛋白，成功獲得了針時(shí)EMCV3AB的特異