豚鼠糖尿病模型的建立和細胞外鉀離子濃度對糖尿病豚鼠乳頭肌動作電位的影響及其機制的研究.pdf

1、糖尿病作為常見的代謝性疾病，可引起心律失常，心肌肥厚，心衰等心血管疾病。而這些疾病的發(fā)生都與心肌細胞膜上離子通道的重構(gòu)有關(guān)。用四氧嘧啶制備的家兔糖尿病模型，出現(xiàn)QT延長，動作電位時程（APD）延長，與心肌細胞的主要復極電流的密度降低有關(guān)，而主要的復極電流為快速延遲整流性鉀離子通道電流(Ikr)和緩慢延遲整流性鉀離子通道電流(Iks)，Ikr通道蛋白由hERG基因編碼，而Iks通道主要由KCNQ1形成的α亞基和KCNE1形成的β亞基組成。

2、當復極電流Ikr和Iks電流密度降低后可使QT和APD延長。本研究旨在觀察實驗性糖尿病豚鼠乳頭肌動作電位的變化及不同濃度的鉀離子對糖尿病豚鼠和正常豚鼠乳頭肌動作電位的影響并分析其機制。
　　 第一部分豚鼠糖尿病模型的建立
　　 目的:制備豚鼠糖尿病模型。
　　 方法:雄性豚鼠20只，體重250-350g，實驗前適應性飼養(yǎng)1周，隨機分為2組，對照組和模型組，每組10只，造模前所有豚鼠饑餓12hr。模型組豚鼠快速靜脈

3、注射200mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)的枸櫞酸緩沖液，對照組注射相同劑量的枸櫞酸緩沖液。分別于給藥當天（第0天）及給藥后第2、7、14天稱量體重，并自耳緣靜脈取血測量血糖濃度;于給藥后14天取各組動物胰腺組織，HE染色后進行病理學觀察;采用細胞內(nèi)玻璃微電極記錄的方法觀察模型組豚鼠乳頭肌動作電位的變化;采用實時定量PCR方法檢測模型組豚鼠心肌組織KCNQ1、ERGRNA的變化。
　　 結(jié)果:(1)模型組豚鼠出現(xiàn)毛色發(fā)暗，身體消瘦

4、，多飲多尿等癥狀，且有4只豚鼠相繼死亡，而對照組動物未見上述表現(xiàn)且全部存活。與對照組相比，給藥后第2天，7天，14天模型組豚鼠體重明顯減輕(p＜0.01)。(2)給藥后第2天，與對照組(6.4±0.6mmol/L)相比，模型組血糖(17.4±1.4mmol/L)明顯增加(p＜0.01)，給藥后第7天模型組血糖(8.6±1.7mmol/L)與第2天相比有所降低，但與對照組(6.4±0.8mmol/L)相比仍明顯增加(p＜0.01)，第14

5、天模型組血糖逐漸恢復，與對照組相比無統(tǒng)計學差異(p＞0.05)。(3)模型組豚鼠胰島細胞受損，細胞數(shù)量明顯減少，呈玻璃樣變。(4)與對照組(102±12ms)相比，模型組APD30（84±8ms）明顯縮短(p＜0.05);與對照組(206±6ms)相比，模型組APD90（168±2ms）明顯縮短(p＜0.01);與對照組(104±11ms)相比，模型組APD90-30(84±6ms)明顯縮短(p＜0.01);與對照組(20±2v/s)相

6、比，模型組Vmax(16±1v/s)明顯減慢(p＜0.01)。(5)與對照組豚鼠心肌ERGRNA(19.63±0.66)相比，模型組豚鼠心肌ERGRNA(5.29±0.15)明顯增加(P＜0.01);與對照組豚鼠心肌KCNQ1RNA(3.48±0.08)相比，模型組豚鼠心肌KCNQ1RNA(1.17±0.05)明顯增加(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:豚鼠快速靜脈注射200mg/kg鏈脲佐菌素后，血糖出現(xiàn)可逆性短暫升高。同時出現(xiàn)體

7、重減輕、多飲多尿的癥狀，與臨床Ⅰ型糖尿病相似。此外出現(xiàn)胰島損傷，APD縮短。因此制備得到豚鼠病理性糖尿病模型。
　　 第二部分細胞外鉀離子濃度對糖尿病豚鼠乳頭肌動作電位的影響及其機制的研究
　　 目的:觀察不同濃度K+對正常豚鼠和糖尿病豚鼠乳頭肌細胞AP的影響并分析其機制。
　　 方法:采用玻璃微電極細胞內(nèi)記錄的方法，觀察在1Hz刺激頻率作用下改變灌流液中K+濃度（1mM，10mM，30mM），觀察其對正常豚鼠和

8、糖尿病豚鼠乳頭肌動作電位參數(shù)（APD90，APD30，APD90-30，Vmax，APA）的影響。采用實時定量PCR方法檢測糖尿病豚鼠心肌組織孵育1mMK+后KCNQ1、ERGRNA的變化。
　　 結(jié)果:(1)1mM鉀離子對正常豚鼠心肌細胞AP的影響:與正常臺氏液APD30(107±5ms)相比，含1mM鉀離子的臺氏液灌流30min后APD30(91±4ms)明顯減?。≒＜0.01）;與正常臺氏液APD90(191±6ms)相比

9、，含1mM鉀離子的臺氏液灌流30min后APD90(246±18ms)明顯增大（P＜0.01）;與正常臺氏液APD90-30(86±5ms)相比，含1mM鉀離子的臺氏液灌流30min后APD90-30(155±16ms)明顯增大（P＜0.01）;與正常臺氏液相比，含1mM鉀離子的臺氏液灌流30min后Vmax和APA無明顯變化（P＞0.05）。(2)1mM鉀離子對糖尿病豚鼠心肌細胞AP的影響:與正常臺氏液APD90(164±8ms)相比

10、，含1mM鉀離子的臺氏液灌流30min后APD90(224±14ms)明顯延長（P＜0.01）;與正常臺氏液APD90-30(68±6ms)相比，含1mM鉀離子的臺氏液灌流30min后APD90-30(121±25ms)明顯增大(P＜0.01);部分乳頭肌細胞出現(xiàn)早后除極和觸發(fā)活動。與正常臺氏液相比，含1mM鉀離子的臺氏液灌流30min后APD30、Vmax和APA無明顯變化（P＞0.05）。(3)10mM鉀離子對正常豚鼠心肌細胞AP的

11、影響:與正常臺氏液APD30(100±9ms)相比，含10mM鉀離子的臺氏液灌流30min后APD30(69±12ms)明顯減小(P＜0.01);與正常臺氏液APD90(200±8ms)相比，含10mM鉀離子的臺氏液灌流30min后APD90(141±10ms)明顯減小(P＜0.01);與正常臺氏液APD90-30(110±12ms)相比，含10mM鉀離子的臺氏液灌流30min后APD90-30(68±4ms)明顯減?。≒＜0.01）;

12、與正常臺氏液APA（126±7mV）相比，含10mM鉀離子的臺氏液灌流30min后APA（109±5mV）明顯減慢(P＜0.01);含10mM鉀離子的臺氏液灌流前后Vmax無明顯變化（P＞0.05）。(4)10mM鉀離子對糖尿病豚鼠乳頭肌的AP的影響:給糖尿病豚鼠乳頭肌灌流含10mM鉀離子的臺氏液30min后APD90（148±11ms）、APD90-APD30（70±5ms）與灌流前APD90（176±6ms）、APD90-APD30

13、（84±7ms）相比明顯減小(P＜0.01);其它指標APA、APD30、Vmax在灌流含10mM鉀離子的臺氏液前后無明顯變化(P＞0.05)。(5)30mM鉀離子對正常豚鼠心肌細胞AP的影響:用含30mM鉀離子的臺氏液灌流30min后APA，APD30，APD90，APD90-30，Vmax與灌流前相比均明顯減小（P＜0.01）。(6)30mM鉀離子對糖尿病豚鼠乳頭肌的AP的影響:用含30mM鉀離子的臺氏液灌流糖尿病豚鼠乳頭肌30mi

14、n后APA，APD30，APD90，APD90-30，Vmax與灌流前相比均明顯減小(P＜0.01)。(7)1mM鉀離子對糖尿病豚鼠心肌組織中KCNQ1、ERGRNA的影響:用含1mM鉀離子的臺氏液孵育糖尿病豚鼠心肌組織30min，其KCNQ1、ERGRNA，與糖尿病豚鼠心肌組織相比，明顯增加(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:細胞外不同濃度K+可改變正常豚鼠和糖尿病豚鼠的AP，低濃度K+(1mM)使正常豚鼠和糖尿病豚鼠APD延長，

15、高濃度K+(10mM)使正常豚鼠和糖尿病豚鼠APD縮短。低濃度K+(1mM)使糖尿病豚鼠心肌細胞Ikr和Iks電流密度增加，但APD卻縮短。
　　 第三部分細胞外高濃度葡萄糖對豚鼠乳頭肌動作電位的影響
　　 目的:觀察細胞外100mM葡萄糖對正常豚鼠和糖尿病豚鼠乳頭肌動作電位的影響。
　　 方法:采用玻璃微電極細胞內(nèi)記錄的方法，觀察在1Hz刺激頻率作用下改變灌流液中葡萄糖濃度(100mM)，觀察其對正常豚鼠和糖尿

16、病豚鼠乳頭肌動作電位參數(shù)(APD90，APD30，APD90-30，Vmax，APA)的影響。
　　 結(jié)果:(1)100mM葡萄糖對正常豚鼠乳頭肌細胞AP的影響:與正常臺氏液APD90(210±9ms)相比，含100mM葡萄糖的臺氏液灌流30min后APD90(196±5ms)明顯縮短(P＜0.01);與正常臺氏液APD390(120±6ms)相比，含100mM葡萄糖的臺氏液灌流30min后APD30(110±7ms)明顯縮短（

17、P＜0.05）;含100mM葡萄糖的臺氏液灌流30min后APD90-30、Vmax和APA無明顯變化（P＞0.05）。(2)100mM葡萄糖對糖尿病豚鼠乳頭肌細胞AP的影響:與正常臺氏液APD90(166±4ms)相比，含100mM葡萄糖的臺氏液灌流30min后APD90(152±5ms)明顯縮短(P＜0.01);100mM葡萄糖灌流30min后，APA，APD30，APD90-30，Vmax與灌流前比較，均無顯著性差異（P＞0.05