雷帕霉素對(duì)2型糖尿病和糖尿病腎病療效及機(jī)制的研究.pdf

1、隨著飲食結(jié)構(gòu)的西方化和體力活動(dòng)的減少，糖尿病患者在發(fā)展中國(guó)家迅速增加，其增長(zhǎng)速度是發(fā)達(dá)國(guó)家的2-3倍<'[1]>。糖尿病腎病是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，約40％的糖尿病患者最終合并腎臟病變<'[2]>。在美國(guó)，糖尿病腎病是終末期腎病的首位原因，占每年新發(fā)病例的42％<'[2]>。在我國(guó)是終末期腎病的第三位原因<'[3]>，占血液透析患者的13.5％，腹膜透析患者的12％。在所有糖尿病患者中，2型糖尿病約占97％，2型糖尿病的核心問題是胰島

2、素抵抗和隨后出現(xiàn)的高血糖，高血糖可通過晚期糖基化產(chǎn)物形成、促進(jìn)多種生長(zhǎng)因子表達(dá)、啟動(dòng)氧化應(yīng)激等多種機(jī)制引起糖尿病患者。腎臟血流動(dòng)力學(xué)異常和細(xì)胞外基質(zhì)積聚，導(dǎo)致腎小球硬化和蛋白尿的產(chǎn)生。 胰島素抵抗是由胰島素受體和受體后缺陷導(dǎo)致胰島素信號(hào)下傳障礙所致，對(duì)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究表明：雷帕霉素靶分子(mammalian target of rapamycin，mTOR)位于胰島素的下游，接受營(yíng)養(yǎng)信號(hào)、能量信號(hào)和生長(zhǎng)因子信號(hào)而調(diào)節(jié)細(xì)胞

3、增殖和生存，并可通過其效應(yīng)分子反饋性抑制胰島素信號(hào)的下傳，引起胰島素抵抗<'[4]>；mTOR還參與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)調(diào)控<'[5-7]>，而VEGF在糖尿病腎病發(fā)病過程中起重要惡化作用。本研究主要探討mTOR特異性抑制劑雷帕霉素治療2型糖尿病和糖尿病腎病的療效及機(jī)制。 目的 探討mTOR特異性抑制劑雷帕霉素治療2型糖尿病及其腎臟損

4、害的療效和機(jī)制； 探討胰島素誘導(dǎo)人系膜細(xì)胞(human mesangial cells，HMCs)VEGF轉(zhuǎn)錄激活的機(jī)制及雷帕霉素抑制VEGF表達(dá)的機(jī)制。 材料、方法 選擇2型糖尿病模型KKAy小鼠，分別應(yīng)用雷帕霉素、長(zhǎng)效人胰島素和安慰劑治療，探討雷帕霉素對(duì)KKAy小鼠血糖、胰島素抵抗及糖尿病腎臟損害指標(biāo)的影響，包括：腎重(kidney weight，KW)、尿白蛋白／肌酐(urine albumin／urine

5、 creatinine，U<,ALB>/Cr)、腎小球體積(glomerular volume，GV)和腎小球基底膜(glomeruIarbasement membmne，GBM)厚度。 應(yīng)用Real-time PCR、Westernblot和免疫組化檢測(cè)KKAy小鼠腎組織VEGF、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)表達(dá)，了解

6、雷帕霉素對(duì)VEGF、CTGF和FN表達(dá)的影響。 應(yīng)用熒光素酶分析、Real-time PCR、Westernblot方法探討胰島素調(diào)節(jié)人腎小球系膜細(xì)胞HMC VEGF轉(zhuǎn)錄激活的機(jī)制，澄清胰島素是否通過P13K／mTOR通路上調(diào)低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)表達(dá)而引起VEGF轉(zhuǎn)錄增加。 結(jié)果 1．16周齡KKAy小鼠表現(xiàn)為肥胖、高血糖和高甘油三酯血癥。治療

7、4周后：雷帕霉素治療組小鼠體重明顯低于對(duì)照組和胰島素治療組，p<0.05。雷帕霉素治療組血糖17.2±7.3mmol／L，低于對(duì)照組29.1±3.2mmol／L，p<0.05。治療8周：雷帕霉素治療組體重顯著低于對(duì)照組(32.2±3.1 VS 39.3±2.8g，p<0.05)，血糖低于對(duì)照組但沒達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(18.2±3.7 VS 24.4±5.1 mmof，L，p=0.06)。 2． 胰島素敏感試驗(yàn)表明：雷帕霉素治療組注射

8、常規(guī)胰島素后，血糖迅速降低，最大降糖作用發(fā)生于60min，為4.88±0.73mmol／L，明顯大于對(duì)照組(2.65±2.12mmol／L，p<0.05)。 3． 16周齡KKAy小鼠與同周齡C57BL小鼠比較表現(xiàn)為KW增加、U<,ALB/Cr>，升高和GV增大。治療后，雷帕霉素治療組KVV、U<,AIb／Cr>、GV明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中GV在治療4w和8w時(shí)均低于胰島素治療組，p<0.05和p<0.01。

9、 4． 治療8w后，對(duì)照組GBM明顯增厚，顯著高于雷帕霉素治療組(284.41+83.73VS144.58±12.70nm)和胰島素治療組(185.82+18.24nm)，p<0.001和p<0.01雷帕霉素治療組GBM厚度略小于胰島素治療組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5．免疫組化結(jié)果顯示：在KKAy小鼠和C57BL小鼠，VEGF主要表達(dá)在遠(yuǎn)端腎小管、小血管內(nèi)皮細(xì)胞，近端腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)較少。正常小鼠腎小球幾乎看不到VEGF表達(dá)，K

10、KAy小鼠腎小球VEGF表達(dá)增加，雷帕霉素治療組腎小球VEGF陽(yáng)性面積低于對(duì)照組和胰島素治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 Real-time PCR結(jié)果顯示：16wKKAy小鼠腎組織VEGF、FN mRNA表達(dá)明顯高于同周齡057BL小鼠，p＜0.05。治療4w和8w后，雷帕霉素治療組VEGF、FN mRNA表達(dá)量明顯低于對(duì)照組和胰島素治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Westernblot結(jié)果顯示：16w KKAy小鼠腎組織VEGFl88、

11、VEGFl64、CTGF蛋白表達(dá)均高于同周齡C57BL小鼠。4w和8w后，雷帕霉素治療組腎臟VEGFl88、VEGFl64蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組，p＜0.01。治療4w時(shí)，雷帕霉素治療組腎臟VEGFl64表達(dá)和治療8w時(shí)VEGF188、VEGF64表達(dá)均低于胰島素治療組，p＜0.01。治療8w時(shí)，胰島素治療組VEGFl88、VEGF164表達(dá)低于對(duì)照組，p＜0.05和p＜0.01。雷帕霉素和胰島素治療對(duì)KKAy小鼠腎臟CTGF表達(dá)無影響

12、。胰島素劑量依賴性增加HMC VEGF轉(zhuǎn)錄，在100nM時(shí)達(dá)高峰，為未刺激組2.14±0.17倍，p＜0.001。胰島素誘導(dǎo)HMC VEGF轉(zhuǎn)錄依賴P13K/mTOR通路和HIF-1表達(dá)。VEGF轉(zhuǎn)錄依賴mTOR的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性。胰島素刺激雖可使轉(zhuǎn)染mTOR-wt、mTOR-RR的HMC VEGF轉(zhuǎn)錄增加，但效應(yīng)明顯弱于轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒，分別為胰島素未刺激組1.29、1.23和1.93倍。雷帕霉素可抑制轉(zhuǎn)染mTOR-WT質(zhì)粒的HMC

13、 VEGF轉(zhuǎn)錄。胰島素或轉(zhuǎn)染具有激酶活性的mTOR質(zhì)?？纱龠M(jìn)HMC HIF-1α蛋白的表達(dá)，但對(duì)HIF-1αmRNA表達(dá)無影響。雷帕霉素可抑制胰島素誘導(dǎo)及轉(zhuǎn)染mTOR-WT質(zhì)粒的HMC HIF-1β蛋白表達(dá)。 結(jié)論 在本實(shí)驗(yàn)條件下： 1.雷帕霉素可降低2型糖尿病小鼠體重、血糖，改善胰島素抵抗； 2.雷帕霉素可減輕2型糖尿病小鼠早期腎臟損害，降低KW、U<,ALB/Cr>、GV； 3.雷帕霉素可延緩