BEV-3D-ELISA的建立及其在牛腸道病毒陽性個體篩選中的應用.pdf

1、牛腸道病毒是小RNA病毒科腸道病毒屬的成員之一，外觀呈球形，正二十面體結構，無包膜，大小約為25～30nm，病毒的基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，全長7.5kb。BEV第一次由Kunin和Mcferran在1957年從健康牛群的糞便中分離得到，隨后全世界陸續(xù)報道了該病毒分離株，但在我國有關該病毒的流行病學調查報道甚少。牛腸道病毒的宿主嗜性比較廣泛，包括羊、犬、人等，目前為止該病毒的病原學研究并不明確，致病機理仍不清楚，臨床癥狀有時會出

2、現腹瀉、繁殖障礙性疾病等，有時也侵入其它器官引起臨床綜合征。
　　本研究以本實驗室分離鑒定并保存的BEV-3531株基因序列為參考序列設計針對3D基因的特異性引物，采用PCR方法擴增得到3D基因，擴增產物克隆到pEASY Blunt Simple Vector(pBsK)，進行測序驗證。驗證該序列為目的片段后，將其克隆到表達載體pET-30a，重組質粒轉化至Rosetta，經IPTG誘導后，SDS-PAGE顯示重組蛋白在大腸桿菌中

3、高效表達，以Ni-NTA柱親和層析法純化蛋白，表達產物經初步純化后，以3D免疫家兔獲得了高效價多克隆抗體，通過Western blotting與間接免疫熒光結果得出3D蛋白具有很好的抗原性。
　　將純化好的3D蛋白作為包被抗原，建立了BEV-3D-ELISA方法并進行了標準化，通過重復性與特異性試驗結果證明本研究建立的I-ELISA特異性、穩(wěn)定性良好。在此基礎上，應用本方法對哈爾濱市送檢的425份奶牛血清進行了檢測，結果顯示3D蛋

4、白與感染牛群血清可以發(fā)生特異性反應且陽性率高達41.41％。
　　為了揭示動物感染牛腸道病毒后體內的3D抗體水平與病毒存在的相關性，利用BEV-3D-ELISA方法檢測BEV-3531株病毒感染乳鼠后的3D抗體消長規(guī)律，同時用RT-PCR檢測感染鼠腸組織中的病毒核酸;另外，用建立的BEV-3D-ELISA方法檢測了哈爾濱市某奶牛群第一批血清樣本42份，同時將42份相應奶牛的糞便樣品進行處理后接種于MDBK細胞并觀察病變情況，然后對

5、發(fā)生病變的細胞上清進行RT-PCR、連接、轉化與序列測定，最后將病變的樣品通過掃描電鏡進行病毒形態(tài)學鑒定;為了防止上述試驗的偶然發(fā)生性又對哈爾濱市同一牛群的血清與糞便樣品22份進行了相同試驗。結果表明動物感染試驗中感染動物體內可檢測出病毒的時間范圍與3D抗體存在的時間范圍符合性良好，都是呈現先上升再降低的趨勢;BEV-3D-ELISA臨床檢測結果顯示第一批42份血清中10份為陽性，第二批22份血清中4份為陽性，RT-PCR結果顯示第一批